[0079] 四、將ssrl_l:SSR和ssrl-2 :SSR在MS固體培養基上培養，根的形態分別如圖2A 中ssrl-1 :SSR和圖2C中ssrl-2 :SSR所示，結果表明，ssrl-Ι和ssrl-2的根短表型通過 轉入SSR基因組序列得到恢復。
[0080] 將空載體PCAMBIA1300進行上述步驟三得到轉入空載體的ssrl-Ι和轉入空載體 的ssrl-2對照植株，兩個對照植株在MS固體培養基上培養后，根的表型與ssrl-l、ssrl-2 的根的表型一致，根顯著短于野生型擬南芥。
[0081] 五、將Col、ssrl-Ι和ssrl-1 :SSR在含有200mM甘露醇的MS培養基上培養，根生 長如圖2B所示。
[0082] 圖2B表明，與野生型擬南芥Col相比，SSR基因部分缺失后對甘露醇脅迫（干旱 脅迫）根生長表現出敏感表型，根顯著短于野生型擬南芥Col，而SSR基因回補后，擬南芥的 根長得到恢復，與野生型擬南芥的根長無顯著性差異。
[0083] 六、將Ws和ssrl-2在MS培養基上培養，根部細胞如圖2D所示。
[0084] 圖2D表明，與野生型擬南芥Ws相比，ssrl-2的根部細胞膨大。
[0085] 實施例5、SSR基因敲除對根生長點處細胞分裂分化狀態的影響
[0086] QC25和wox5是監測植物根靜止中心細胞狀態的marker基因，將其標記可用于根 靜止中心細胞的活性的檢測，由于根的靜止中心活性直接影響到根的生長，所以QC25和 wox5也可以反應根的生長狀態。
[0087] 一、將突變體ssrl-2分別和帶有QC25:⑶S標簽和wox5 :GFP標簽的轉基因擬南芥 雜交，分別得到敲除SSR基因的含有QC25:⑶S標簽的F2代植株或者敲除SSR基因的含有 wox5 :GFP標簽的F2代植株。
[0088] 同時將擬南芥Col-Ο生態型分別和帶有QC25:⑶S標簽和wox5 :GFP標簽的轉基因 擬南芥雜交，分別得到未敲除SSR基因的含有QC25:GUS標簽的F2代植株或者未敲除SSR 基因的含有wox5 :GFP標簽的F2代植株。
[0089] 二、對未敲除SSR基因的含有QC25:⑶S標簽的F2代植株（轉QC25:⑶S的WT)和 敲除SSR基因的含有QC25:⑶S標簽的F2代植株（轉QC25:⑶S的ssr1-2)進行⑶S染色， 兩種植株中的QC25的表達結果分別如圖3中A和B所示。
[0090] 對未敲除SSR基因的含有wox5 :GFP標簽的F2代植株（轉wox5 :GFP的WT)和敲 除SSR基因的含有wox5 :GFP標簽的F2代植株（轉wox5 :GFP的ssrl-2)的進行熒光檢測， 兩種植株中的wox5的表達結果分別如圖3中C和D所示。
[0091] 圖3表明，SSR基因敲除減弱了QC的活性，表現為QC25表達減弱，而wox5的表達 范圍變大。實驗證明，與野生型擬南芥相比，SSR基因敲除擬南芥分生區細胞的分裂能力減 弱。
[0092] 實施例6、SSR基因敲除對根發育相關基因的影響
[0093] 將突變體ssrl-2 分別和帶有PLTlpro:CFP、PLT2pro:CFP、PLTlpra:PLTl:YFP、 PLT2pro:PLT2:YFP標簽的轉基因擬南芥雜交，分別得到敲除SSR基因的并且含有 PLTlpro:CFP、PLT2pro:CFP、PLTlpro:PLTl:YFP或PLT2pra:PLT2:YFP標簽的F2 代植株。
[0094] 同時將擬南芥Col-Ο生態型分別和帶有PLTlpro:CFP、PLT2pra:CFP、 PLTlpro:PLT1:YFP、PLT2pro:PLT2:YFP標簽的轉基因植株雜交，分別得到未敲除SSR基因的 并且含有PLTlpro:CFP、PLT2pro:CFP、PLTlpro:PLTl:YFP或PLT2pro:PLT2:YFP標簽的F2 代植 株。
[0095] 未敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:CFP的F2代植株（轉PLTlpra:CFP的WT)的PLT1基因的RNA表達檢測結果如圖4中A所示。
[0096] 敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:CFP的F2代植株（轉PLTlpro:CFP的ssrl-2)的 PLT1基因的RNA表達檢測結果如圖4中B所示。
[0097] 未敲除SSR基因的并且含有PLT2pro:CFP的F2代植株（轉PLT2pra:CFP的WT)的PLT2基因的RNA表達檢測結果如圖4中C所示。
[0098] 敲除SSR基因的并且含有PLT2pr。:CFP的F2代植株（轉PLT2pr。:CFP的ssr1-2)的 PLT2基因的RNA表達檢測結果如圖4中D所示。
[0099] 未敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:PLT1:YFP的F2代植株（轉PLTlpra:PLT1:YFP 的WT)的PLT1蛋白表達檢測結果如圖4中E所示。
[0100] 敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:PLT1:YFP的F2代植株（轉PLTlpra:PLT1:YFP的 ssrl-2)的PLT1蛋白表達檢測結果如圖4中F所示。
[0101] 未敲除SSR基因的并且含有PLT2pro:PLT2:YFP的F2代植株（轉PLT2pra:PLT2:YFP 的WT)的PLT2蛋白表達檢測結果如圖4中G所示。
[0102] 敲除SSR基因的并且含有PLT2pro:PLT2:YFP的F2代植株（轉PLT2pra:PLT2:YFP的 ssrl-2)的PLT2蛋白表達檢測結果如圖4中Η所示。
[0103] 圖4中A、B、C和D表明，SSR基因敲除后，PLT基因的RNA表達水平沒有變化。圖 4中E、F、G和Η表明，SSR基因敲除導致PLT蛋白表達水平降低，表明根部分生區細胞的分 化能力減弱。
[0104] 實施例7、SSR基因敲除對生長素運輸的影響
[0105] DR5是生長素響應基因，將其標記可用于生長素分布的檢測。
[0106] 一、將擬南芥Col-Ο生態型和突變體ssrl-2分別與帶有生長素標記DR5rev:GFP 的轉基因植株雜交，分別得到未敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP標簽的F2代植株以（轉 DR5rev:GFP的WT)及敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP標簽的F2代植株（轉DR5rev:GFP 的ssrl-2)〇
[0107] 未敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP標簽的F2代植株（轉DR5rev:GFP的WT)的 DR5基因的表達檢測結果如圖5中A所示。
[0108] 敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP標簽的F2代植株（轉DR5rev:GFP的ssrl-2) 的DR5基因的表達檢測結果如圖5中B所示。
[0109] 與轉DR5rev:GFP的WT相比，轉DR5rev:GFP的ssrl-2的根部生長素濃度和梯度 分布發生變化，具體為DR5基因在根尖處表達降低，說明生長素分布減少，同時靜止中心 細胞（QC)處不再是DR5基因表達最高的地方，說明生長素濃度梯度分布也發生了變化。
[0110] 二、將突變體ssrl-2和擬南芥Col-ο生態型分別與帶有PINlpro:PINl:GFP 的轉基因擬南芥雜交，得到F2代植株，分別為轉PINlpro:ΡΙΝΙ:GFP的ssr1-2和轉 PINlpro:PINl:GFP的WT。
[0111] 將突變體ssr1-2和擬南芥Col-ο生態型分別與帶有PIN2pro:PIN2:GFP的 轉基因擬南芥雜交，得到F2代植株，分別為轉PIN2pro:PIN2:GFP的ssr1-2和轉 PIN2pro:PIN2:GFP的WT。
[0112] 將突變體ssrl-2和擬南芥Col-Ο生態型分別與帶有PIN3pro:PIN3:GFP的 轉基因擬南芥雜交，得到F2代植株，分別為轉PIN3pr〇:PIN3:GFP的ssrl-2和轉 PIN3pro:PIN3:GFP的WT。
[0113] 將突變體ssr1-2和擬南芥Col-Ο生態型分別與帶有PIMpro:PIN4:GFP的 轉基因擬南芥雜交，得到F2代植株，分別為轉PIN4pr〇:PIN4:GFP的ssrl-2和轉 PIMpro:PIN4:GFP的WT。
[0114] 將突變體ssrl-2和擬南芥Col-Ο生態型分別與帶有PIN7pro:PIN7:GFP的 轉基因擬南芥雜交，得到F2代植株，分別為轉PIN7pro:PIN7:GFP的ssr1-2和轉 PIN7pro:PIN7:GFP的WT。
[0115] 各植株的PIN蛋白表達測結果如圖6所示。
[0116] 圖6表明，和野生型擬南芥相比，SSR基因敲除突變體中生長素載體運輸蛋白的表 達量都降低，表明生長素運輸受到了阻礙。
[0117]五、轉PIN2pro:PIN2:GFP的ssrl-2和轉PIN2pro:PIN2:GFP的WT的PIN2蛋白表 達檢測結果如圖7所示。
[0118]圖7中，左圖為轉PIN2pro:PIN2:GFP的WT，右圖為轉PIN2pro:PIN2:GFP的 ssrl_2〇
[0119] 圖7表明，SSR基因敲除直接影響了PIN2蛋白的亞細胞定位，使PIN2蛋白（如圖 7中箭頭所示）大部分定位在細胞質中。而在野生型擬南芥中，PIN2蛋白絕大部分定位在 細胞膜上。SSR基因敲除后，PIN2蛋白無法正常定位在行使功能的細胞膜上，說明SSR基因 突變體中PIN2蛋白功能缺失，從而導致生長素在突變體中運輸受阻。
【主權項】
1. 一種抑制植物的根生長的方法，是敲除植物中的SSR基因。2. -種促進植物的根生長的方法，是使SSR基因在植物中過表達。3. -種抑制植物中生長素運輸的方法，是敲除植物中的SSR基因。4. 一種降低植物抗旱能力的方法，是敲除植物中的SSR基因。5. -種提高植物抗旱能力的方法，是使SSR基因在植物中過表達。6. 根據權利要求2或5所述的方法，其特征在于：所述使SSR基因在植物中過表達的 方法是將含有所述SSR基因的重組表達載體導入所述植物中。7. 根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述植物為擬南芥； 所述SSR基因為擬南芥的SSR基因。 8. SSR基因在促進植物的根生長或提高植物的抗旱能力中的應用。 9. SSR基因作為靶點在抑制植物的根生長、抑制植物中生長素運輸或降低植物的抗旱 能力中的應用。10. 根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于：所述植物為擬南芥； 所述SSR基因為擬南芥的SSR基因。
【專利摘要】本發明公開了一種SSR基因在調控植物根生長發育和生長素運輸中的應用。本發明公開一種抑制植物的根生長的方法，是敲除植物中的SSR基因。本發明證明擬南芥SSR基因在植物的根生長及生長素運輸中發揮了重要作用。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82
【公開號】CN105463010
【申請號】CN201410451829
【發明人】華學軍, 張敏
【申請人】中國科學院植物研究所
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年9月5日