r>[0049] 實施例3轉化
[0050]取10yL連接產物轉化入大腸桿菌DH5a感受態細胞中，全部菌液涂布于含Kan抗性 的LB固體平板上，于37°C溫度下培養16h，在平板上長出多個單菌落，如圖3所示。挑取單菌 落于10mL含Kan的LB液體培養基中，于37°C溫度下、以200rpm的轉速培養16h，取200yL菌液 送上海英濰捷基公司進行測序檢驗。測序結果如圖4所示，其中，Query為基因庫序列，Sbjct為測序結果。本測序結果與NCBI基因庫中IFN-ε基因的序列完全一致。
[0051] 實施例4表達IFN-ε蛋白
[0052]將重組質粒與分子伴侶共同轉入表達菌BL21(DE3)感受態細胞中，挑菌于10mL含 Kan和Cm的LB液體培養基中，于37°C溫度下、以200rpm的轉速培養16h后按照體積比為1:100 的比例擴培，向培養基中加入kan、氯霉素和L-阿拉伯糖，使其在培養基中的濃度分別為20μ 區/1111^、2(^8/1111^和0.511^/1111，于37°(3溫度下、以200印1]1的轉速培養411后，于37°(3溫度下、以 200rpm的轉速培養4h后，加入IPTG使其在培養基中的濃度為0 .ImM/L，于16°C溫度下、以 200rpm的轉速培養24h。
[0053] 圖5為實施例4的IPTG誘導表達IFN-ε蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中，A為未加入分子 伴侶的表達IFN-ε蛋白，1、2為對照菌(不含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白 條帶;3、4為實驗菌(含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白條帶。B為加入分子 伴侶的表達IFN-ε蛋白，1、2為實驗菌(含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白條 帶。由圖5可知，未加分子伴侶時表達的IFN-ε蛋白基本是在菌體沉淀中，為包涵體表達（圖 5A);加入分子伴侶后表達的IFN-ε蛋白有相當部分處于菌液上清中，屬于可溶性表達（圖 5B)，說明成功獲得了可溶性的IFN-ε蛋白。
[0054]實施例5蛋白純化
[0055]依次用Ni柱、陰離子交換層析和分子篩將IFN-ε蛋白與其他雜蛋白分離開來，獲得 純度較高的IFN-ε蛋白。
[0056]Ni柱純化的具體步驟為:先用Bindingbuffer平衡Ni柱10個柱體積，然后上樣，再 用Bindingbuffer沖洗至紫外吸收線達到基線，換Elutionbuffer洗脫，收集洗脫峰。其 中，Binding13此€61:11^，含2〇111]\1的磷酸緩沖液、50〇111]\1的氯化鈉和4〇111]\1的咪唑4!1為8.0 ; Elutionbuffer:lL，含20mM的磷酸緩沖液、500mM的氯化鈉和500mM的咪唑，pH為8.0。所用 儀器為AKTAprimeplus。
[0057]陰離子交換層析純化具體步驟為:先用Bindingbuffer平衡柱子8個柱體積，然后 上樣，再用Elutionbuffer梯度洗脫，在12個柱體積共60mL中含量從0%到100 %，再沖洗5 個柱體積，收集期間出現的峰。其中，Bindingbuffer: 1L,含20mM的磷酸緩沖液和500mM的 氯化鈉，pH為8 · 0;Elutionbuffer: 1L，含20mM的磷酸緩沖液和ImM的氯化鈉，pH為8 · 0。所用 儀器為AKTApurifier，柱子為HiTrapQHP5mL柱子。
[0058] 分子篩純化的具體步驟為：先用buffer平衡2倍柱體積，上樣，再用buffer沖洗1 · 5 倍柱體積，沖洗時收集出現的峰。其中，buffer:1L，含20mM的磷酸緩沖液和250mM的氯化鈉，pH為8.0。所用儀器為AKTApurifier，柱子為HiLoad16/60Superdex75prepgradel20mL 柱子，
[0059] 純化后得到純度高達95%以上的IFN-ε蛋白。純化后的IFN-ε蛋白的SDS-PAGE電泳 圖如圖6所示，其中，1為純化后的IFN-ε蛋白，2為雜蛋白。
[0060] 實施例6IFN-e蛋白的鑒定
[0061] 使用WesternBlot方法鑒定純化所得到的蛋白是否為IFN-ε蛋白。首先跑SDS- PAGE電泳，后將電泳條帶轉移到0.4umPVDF膜上，5 %脫脂奶粉固定后，孵一抗4°C過夜，然后 孵羊抗兔二抗室溫lh，加發光液曝光，結果如圖7所示，其中，1、2為兩個重復樣品。從圖7可 以看出，在36KD處有很明顯的一條帶，說明所得樣品中的蛋白為IFN-ε蛋白。
[0062]實施例7轉接小鼠制備多克隆抗體
[0063] 建立小鼠模型，注射IFN-ε蛋白，15天后再次注射IFN-ε蛋白，此后每隔8天注射一 次IFN-ε蛋白，收集小鼠血液，檢驗是否產生抗體，經檢驗，有抗體產生。
[0064]此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包 含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當 將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員 可以理解的其他實施方式。
【主權項】
1. 可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于，具體步驟為： a)PCR擴增 根據被證實的人IFN-ε基因的序列，設計特異性擴增引物，并進行PCR擴增反應； (2) 酶切和連接 將PCR擴增產物及pET40b質粒進行酶切，回收酶切后的IFN-ε基因和pET40b質粒，將二 者按照體積比15:2的比例進行連接； (3) 表達IFN-ε蛋白： 將步驟(2)得到的連接產物與分子伴侶共同轉入表達菌感受態細胞中培養44h，在培養 過程中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷； (4) 蛋白純化： 將IFN-ε蛋白與其他雜蛋白分離開。2. 根據權利要求1所述的可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于:步驟（1)中人IFN-ε基因的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；人IFN-ε基因的下游擴增引物的 核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3. 根據權利要求1所述的可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于：步驟（1)中所述 PCR擴增反應的條件為:先于94°C溫度下預熱5min;以94°C溫度下變性30s、58°C溫度下退火 30s、72°C溫度下延伸1.5min為一個循環，共循環33次;在72°C溫度下處理lOmin。4. 根據權利要求1所述的可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(2)中酶切反 應具體步驟為:PCR擴增產物及pET40b質粒同時用EcoRI和Xhol雙酶切，在37°C溫度下反應 2h〇5. 根據權利要求1所述的可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(2)中連接反 應條件為:將酶切后的IFN-ε基因與pET40b質粒在T4DNA連接酶作用下，室溫下連接30min。6. 根據權利要求1所述的可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(3)中加入異 丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的量為:使其在培養基中的濃度為0.ImM/L。7. 根據權利要求6所述的可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(3)中培養的 具體過程為:挑菌于液體培養基中，于37°C溫度下、以200rpm的轉速培養16h后按照體積比 1:100的比例擴培，向培養基中加入卡那霉素、氯霉素和L-阿拉伯糖，使其在培養基中的濃 度分別為20yg/mL、20yg/mL和0.5mg/ml，于37°C溫度下、以200rpm的轉速培養4h后，加入異 丙基-β-D-硫代R比喃半乳糖苷，于16°C溫度下、以200rpm的轉速培養24h。8. 根據權利要求1所述的可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其特征在于，經過步驟(4)后得 到的可溶性IFN-ε蛋白的純度在95 %以上。9. 權利要求1-8任一項所述制備方法得到的可溶性IFN-ε蛋白在制備多克隆抗體中的 應用。
【專利摘要】本發明涉及一種可溶性IFN-ε蛋白的制備方法。該方法包括PCR擴增、酶切和連接、表達IFN-ε蛋白和蛋白純化步驟。本發明解決了在體外大量表達IFN-ε蛋白時不能獲得可溶性、具備天然活性的IFN-ε蛋白的難題，成功得到可溶性的IFN-ε蛋白，并制備成多克隆抗體，為深入研究IFN-ε的生物學特性及其與陰道炎、宮頸癌等常見疾病的發病關系提供理論基礎及實驗保障。
【IPC分類】C07K14/555, C12N15/70, C07K16/24, C12N15/20
【公開號】CN105462988
【申請號】CN201610046087
【發明人】張慶華, 劉威, 謝秋波, 常秋霜
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月22日