可溶性IFN-ε蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體涉及可溶性IFN-ε蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002] 干擾素（IFNs)是一種多功能的分泌型蛋白質，參與抗病毒、細胞生長調節、免疫調 節等過程。其中，I型干擾素在整個干擾素家族中占有很大比重，也是目前研究最多、應用最 廣的干擾素。IFN-ε屬于I型干擾素家族，人的IFN-ε的編碼基因位于第9號染色體短臂上 (9p22.2)，沒有內含子，全長編碼192個氨基酸。不同于其他干擾素，IFN-ε可以組成性表達 于人肺、腦、小腸和生殖組織等部位，它的這種表達使它可能具有了除I型干擾素抗病毒、抗 腫瘤、調節機體免疫功能等作用之外的一些特性，但目前對其的研究還不清楚。
[0003]近期研究發現，IFN-ε可以在女性生殖道上皮細胞中組成性表達并且受雌激素的 調節，IFN-ε在女性生殖道感染的治療中是一個可以發揮強力效用的抗病原藥及免疫調節 細胞因子。因此，將IFN-ε蛋白制備成抗體用于治療女性生殖道感染等病癥將會對整個全球 人類健康具有重要貢獻。目前，但現今所報道出的文獻中所做的IFN-ε基因表達的蛋白一直 是在包涵體中表達而不具有天然的蛋白活性，從而不能用來制作抗體。
【發明內容】
[0004] 本發明目的之一在于針對上述無法得到可溶性IFN-ε蛋白的問題，通過加入一種 分子伴侶使人IFN-ε基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達出可溶性的IFN-ε融合蛋白并純 化得到純度較高的IFN-ε蛋白，可以用來制作抗體。
[0005]為實現上述目的，本發明的技術方案為：
[0006]可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其具體步驟為：
[0007] (l)PCR擴增
[0008]根據被證實的人IFN-ε基因的序列，設計特異性擴增引物，并進行PCR擴增反應；
[0009] (2)酶切和連接
[0010] 將PCR擴增產物及pET40b質粒進行酶切，回收酶切后的IFN-ε基因和pET40b質粒， 將二者按照體積比15:2的比例進行連接；
[0011] (3)表達IFN-ε蛋白：
[0012]將步驟（2)得到的連接產物與分子伴侶共同轉入表達菌感受態細胞中培養40-48h，在培養過程中加入異丙基-β-D-硫代啦喃半乳糖苷；
[0013]⑷蛋白純化：
[0014]將IFN-ε蛋白與其他雜蛋白分離開。
[0015]所述感受態細胞(competentcell)是用理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和 容納外來DNA的生理狀態的細胞。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說， 使得細胞膜表面出現一些孔洞，便于外源基因或載體進入感受態細胞。由于細胞膜的流動 性，這種孔洞會被細胞自身所修復。
[0016]進一步，步驟（1)中人IFN-ε基因的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQIDN0:1所 示;人IFN-ε基因的下游擴增引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0017] 詳見下表：
[0019]進一步，步驟（1)中所述PCR擴增反應的條件為:先于94°C溫度下預熱5min;以94°C溫度下變性30s、58°C溫度下退火30s、72°C溫度下延伸1.5min為一個循環，共循環33次;在 72°C溫度下處理lOmin。
[0020] 進一步，步驟(2)中酶切反應具體步驟為:PCR擴增產物及pET40b質粒同時用EcoRI 和Xhol雙酶切，在37°C溫度下反應2h。
[0021]進一步，步驟(2)中連接反應條件為:將酶切后的IFN-ε基因與pET40b質粒在T4DNA 連接酶作用下，室溫下連接30min。
[0022] 進一步，步驟(3)中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的量為:使其在培養基中 的濃度為0.1mM/L。
[0023] 所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷英文名稱為IPTG，為白色粉末，是一種作用極 強的誘導劑，溶于水后呈清亮無色液體。用于原核表達系統，使其表達量增高，產物穩定。此 處IPTG作為誘導劑，誘導IFN-ε基因的表達。
[0024]進一步，步驟(3)中培養的具體過程為：挑菌于液體培養基中，于37°C溫度下、以 200rpm的轉速培養16h后按照體積比1:100的比例擴培，向培養基中加入卡那霉素(Kan)、氯 霉素和L-阿拉伯糖，使其在培養基中的濃度分別為20yg/mL、20yg/mL和0.5mg/ml，于37°C溫 度下、以200rpm的轉速培養4h后，加入異丙基-β-D-硫代R比喃半乳糖苷，于16°C溫度下、以 200rpm的轉速培養24h。
[0025] 進一步，經過步驟(4)后得到的可溶性IFN-ε蛋白的純度在95%以上。
[0026]本發明的目的之二在于保護利用上述述制備方法得到的IFN-ε蛋白在多克隆抗體 中的應用，制備得到的多克隆抗體為一些常見疾病如陰道炎、子宮內膜癌等的檢測與預防 提供了更為方便的途徑和治療方法。
[0027]本發明的有益效果在于：
[0028]本發明解決了在體外大量表達IFN-ε蛋白時不能獲得可溶性、具備天然活性的 IFN-ε蛋白的難題，成功得到可溶性的IFN-ε蛋白，并制備成多克隆抗體，為深入研究IFN-ε 的生物學特性及其與陰道炎、宮頸癌等常見疾病的發病關系提供理論基礎及實驗保障。
【附圖說明】
[0029]圖1為實施例1的PCR擴增IFN-ε基因電泳圖，其中，1、2、3為PCR產物條帶，Μ為 D2000DNA條帶；
[0030]圖2為實施例2的酶切反應電泳圖，其中，1、2、3、4為IFN-ε基因酶切后條帶，5為pET40b質粒酶切后條帶；
[0031]圖3為實施例3的IFN-ε基因和pET40b質粒的連接產物轉化結果圖；
[0032]圖4為實施3的測序結果與基因庫序列比對圖，其中，Query為基因庫序列，Sbjct為 測序結果；
[0033] 圖5為實施例4的IPTG誘導表達IFN-ε蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中，A為未加入分子 伴侶的表達IFN-ε蛋白，1、2為對照菌(不含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白 條帶;3、4為實驗菌(含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白條帶。B為加入分子 伴侶的表達IFN-ε蛋白，1、2為實驗菌(含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白條 帶；
[0034]圖6為實施例5的純化后的IFN-ε蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中，1為純化后的IFN-ε蛋 白，2為雜蛋白；
[0035]圖7為實施例6的WesternBlot鑒定結果，其中，1、2為兩個重復樣品。
【具體實施方式】
[0036] 所舉實施例是為了更好地對本發明的內容進行說明，但并不是本發明的內容僅限 于所舉實施例。所以熟悉本領域的技術人員根據上述
【發明內容】
對實施方案進行非本質的改 進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
[0037] 實施例1PCR擴增
[0038] (1)特征性引物的設計
[0039] 根據已知的人IFN-ε基因，使用PrimerPremier6.0軟件設計特性擴增引物，引物 委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。最優的PCR擴增引物詳見表1。
[0040] 表1人IFN-ε基因擴增引物
[0042] (2)PCR擴增反應
[0043]PCR反應各組分及相應體系為：10XExBuffer(含Mg2+)5yLul;dNTP4yL;上游擴增 引物lyL;反向引物lyL;ExTaq酶0 · 3yL;DNA模板2yL;加滅菌高純雙蒸水至50yL。
[0044]PCR擴增反應的條件為:先于94°C溫度下預熱5min;以94°C溫度下變性30s、58°C溫 度下退火30s、72°C溫度下延伸1.5min為一個循環，共循環33次;在72°C溫度下處理lOmin。
[0045] 結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的基因條帶，在大約565bp處切膠回收。 電泳圖如圖1所示，其中，1、2、3為PCR產物條帶，Μ為D2000DNA條帶。
[0046] 實施例2酶切和連接
[0047] 將回收到的PCR產物及pET40b質粒同時用ΝΕΒ公司的EcoRI和Xhol雙酶切，于37°C 溫度下反應2h，電泳切膠回收。電泳圖如圖2所示，其中，1、2、3、4為IFN-ε基因酶切后條帶，5 為pET40b質粒酶切后條帶。
[0048] 回收酶切后的IFN-ε基因和pET40b質粒，按照IFN-ε基因和pET40b質粒以體積比 15:2的比例在NEB公司的T4DNA連接酶的作用下，室溫下連接30min。