mMEDTA，質量濃度為 2.5%的〇^8和2 111]\1的01'1'; 所述數字PCR反應緩沖液A包括HBV-B型的引物及探針和HBV-C型的引物及探針;所述數 字PCR反應緩沖液B包括內標的引物及探針;所述HBV-B型、HBV-C型和內標的引物及探針如 下所示： HBV-B型和HBV-C型通用上游引物： CTAGACTCGTGGTGGACTTCTC； HBV-B型和HBV-C型通用下游引物： ATGAGGCATAGCAGCAGGAT； HBV-B 型探針：TCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTC; HBV-C 型探針：TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCA; 內標上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG; 內標下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG; 內標探針:ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC; 所述HBV-B型探針5'端熒光報告基因為FAM，HBV-C型探針5'端熒光報告基團為VIC，內 標探針5 '端熒光報告基團為VIC，所有探針3 '端淬滅基團均為BHQ; 所述HBV-B病毒基因陽性質控為HBV-B的標準質粒溶液，該標準質粒溶液的濃度可以是 100 copies/yL;所述HBV-C病毒基因陽性質控為HBV-C的標準質粒溶液，該標準質粒溶液的 濃度可以是100 copies/yL; 所述陰性質控為滅菌生理鹽水； 所述內標溶液為β-globin的標準質粒溶液，該標準質粒溶液的濃度可以是100 copies/uL〇
[0019] 上述數字PCR反應緩沖液A可以包括:4 mM MgCl2、50 mM pH 8.3的Tris-HCl、300 mM dNTP、900 nM所述HBV-B型和HBV-C型通用上游引物、900 nM所述HBV-B型和HBV-C型通 用下游引物、250 nM所述HBV-B探針和250 nM所述HBV- C探針； 所述數字PCR反應緩沖液B可以包括:4 mM MgCl2、50 mM pH 8.3的Tris-HCl、300 mM dNTP、900 nM所述內標上游引物、900 nM所述內標下游引物和250 nM所述內標探針。
[0020] 上述數字PCR反應緩沖液A和數字PCR反應緩沖液B中還可以均含有熱啟動Taq酶和 UDG酶，其中Taq酶和UNG酶的濃度均為1 U/yL。
[0021] 二、一種用于檢測HBV-B/C的數字PCR絕對定量分型的檢測方法，采用上述用于檢 測HBV-B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒進行檢測，具體檢測方法包括如下步驟： (1)受檢樣品處理:將待測樣品用無菌生理鹽水洗滌并離心棄去上清液后，加入滅菌水 震蕩混勻，向震蕩混勻后的溶液中加入所述試劑盒中的DNA提取液和內標溶液，劇烈震蕩混 勾，并于100~105°C恒溫處理10~16分鐘，再于12,000~14,000印111/111；[11離心5~10分鐘，取上清 液，獲得PCR擴增樣品DNA模板； (2) 質控品的處理:分別取所述試劑盒中的HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽 性質控和陰性質控，按照與步驟（1)相同的方法處理，分別得到HBV-B病毒基因陽性質控、 HBV-C病毒基因陽性質控和陰性質控的DNA模板； (3) 配制數字PCR反應混合液：向步驟（1)和步驟(2)處理后得到的樣品DNA模板、HBV-B 病毒基因陽性質控DNA模板、HBV-C病毒基因陽性質控DNA模板和陰性質控DNA模板中分別加 入滅菌水和所述試劑盒中的數字PCR反應緩沖液，分別配制得到樣品、HBV-B病毒基因陽性 質控、HBV-C病毒基因陽性質控和陰性質控的數字PCR反應混合液;其中，陽性質控和陰性質 控的數字PCR反應混合液均采用數字PCR反應緩沖液A配制，樣品的數字PCR反應混合液分為 兩種，分別采用數字PCR反應緩沖液A和數字PCR反應緩沖液B配制； (4 )將步驟(3 )制備的樣品、HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽性質控和陰性 質控的數字PCR反應混合液分別制作為油包水PCR微反應液滴，生成的微反應液滴數量為 10，000~20，000個，然后對所述微反應液滴進行PCR擴增反應； (5)讀取熒光信號:步驟(4)PCR擴增后，將PCR反應板放入熒光讀取儀器中，分別在FAM 和VIC通道中進行HBV-B和HBV-C的分型檢測，通過Quanta sof t軟件進行定量分析，計算出 HBV-B型和/或HBV-C型的拷貝數。
[0022]上述檢測方法中，步驟（1)所述滅菌水、DNA提取液和內標溶液的體積比可以為 100:100:1。
[0023]步驟(3)中所述數字PCR反應緩沖液、滅菌水和DNA模板的體積比可以為2:1: 1。 [0024] 步驟(4)中的數字PCR擴增反應條件可以為:95°C變性5分鐘;95°C變性10秒，60°C 延伸60秒，共進行30個循環;98°C變性10分鐘，4°C停止反應。
[0025] 三、HBV-B/C引物探針設計和特異性檢測： 1、HBV-B/C病毒通用引物和探針設計 為了能夠利用數字PCR的方法檢測樣品中的HBV-B/C病毒，根據NCBI公布的HBV-B/C基 因序列，設計可以擴增HBV-B型和C型的通用引物、探針。
[0026] 2、引物特異性驗證 為驗證所設計的引物和探針的特異性，設計單重數字PCR反應，用上述檢測試劑盒和方 法進行檢測，具體包括如下步驟： 1) 取HBV-B、C型病毒陽性臨床樣品（樣品來自西南醫院)進行，按照以下步驟提取核酸 DNA； 2) 向樣品收集管中加入2 mL無菌生理鹽水，將樣品完全侵入液體中，充分震蕩混勻，將 全部液體轉移至相應樣品編碼的離心管中； 3) 將相應樣品溶液的離心管于10,000印111/1^11離心3分鐘，棄上清； 4) 向步驟3)棄上清后的離心管中重新加入1 mL無菌生理鹽水，充分震蕩洗滌，于10， 000rpm/min離心3分鐘，棄上清； 5) 向步驟5)離心棄上清后的離心管中加入500 uL滅菌水，充分震蕩混勻； 6) 取200 yL步驟5)震蕩均勻后的溶液，加入500 yL DNA提取液（50 mM Tris-HCl (ρΗ8·3)，0·5 M NaCl，5 mM EDTA，1.5%的CTAB，2 mM的DTT)和5 yL的內標溶液（100 copies/ul的β-globin的標準質粒），劇烈震蕩混勾15秒； 7)將上述混合并震蕩均勻的溶液，于100°C恒溫處理10分鐘，再于12,000 rpm離心5分 鐘，取上清液，分別得到PCR擴增DNA模板，備用。
[0027] 8)配制數字PCR反應混合液，在各反應管中加入HBV_B、C型的引物和探針;配制好 的數字PCR反應混合液中含有10 uL相應數字PCR反應緩沖液（內含Taq酶、dNTP、相應引物探 針組合）、5 uL步驟7)提取的相應DNA模板和5tiL滅菌水； 9)將上述步驟8)配制好的數字PCR反應混合液放置于微滴生成器中，制作油包水微反 應液滴;再放置于PCR儀中，進行數字PCR擴增，擴增程序為:95°C變性5分鐘;95°C變性10秒， 60°C延伸60秒，共進行30個循環;98°C變性10分鐘，4°C停止反應。
[0028] 10)步驟9)擴增結束后，放置PCR微反應液滴信號讀取儀中進行信號收集，在FAM和 VIC通道分別檢測FAM和VIC熒光信號，驗證引物特異性。以HBV-B型DNA為模板，同時用HBV-B、HBV-C的通用引物和探針進行檢測，只有FAM通道檢測到信號詳見圖1，而VIC通道未檢測 到信號詳見圖2;以HBV-C型DNA為模板，同時用HBV-B、HBV-C的通用引物和探針進行檢測，只 有VIC通道檢測到信號詳見圖3,而FAM通道未檢測到信號詳見圖4。由上述可以看出，本發明 引物特異性良好。
[0029]四、利用上述試劑盒，對沒有被HBV-B/C型感染的陰性樣品、感染HBV-B型樣品及感 染HBV-C型樣品進行絕對定量分型檢測，檢測操作如下： 1、樣本處理與DNA提取(在樣本制備區） 1) 向樣品收集管中加入2 mL無菌生理鹽水，使樣品完全侵入液體中，充分震蕩混勻，將 全部液體轉移至相應樣品編碼的離心管中； 2) 將相應樣品溶液的離心管于10,000印111/1^11離心3分鐘，棄上清； 3) 向步驟2)棄上清后的離心管中重新加入1 mL無菌生理鹽水，充分震蕩洗滌，于10， 000rpm/min離心3分鐘，棄上清； 4) 向步驟3)離心棄上清后的離心管中加入500 nL滅菌水，充分震蕩混勻； 5) 取200 yL步驟4)震蕩均勻后的溶液，加入500 yL DNA提取液（50 mM Tris-HCl (ρΗ8·3)，0·5 M NaCl，5 mM EDTA，1.5%的CTAB，2 mM的DTT)和5 yL的內標溶液（100 copies/ul的β-globin特異擴增區的標準質粒），劇烈震蕩混勾15秒； 6) 將上述混合并震蕩均勻的溶液，于100°C恒溫處理10分鐘，再于12,000 rpm離心5分 鐘，取上清液，得到PCR擴增DNA模板，備用。
[0030] 2、質控品處理(樣本制備區） 分別取所述試劑盒中的HBV-B/C陽性質控（100 copies/ul HBV-B/C特異擴增區的標準 質粒混合液）、陰性質控離心管(滅菌生理鹽水），按照上述"1、樣品處理與DNA提取"相同的 步驟進行操作，分別得到相應的DNA模板。 3、數字PCR試劑準備(試劑準備區） 取PCR反應管，依次按照以下配比分別配制陽性質控、陰性質控、樣品的數字PCR反應混 合液，具體配比如下表1所示;其中，陽性質控和陰性質控的數字PCR反應混合液均采用數字 PCR反應緩沖液A配制，樣品的數字PCR反應混合液分為兩種，分別由數字PCR反應緩沖液A和 數字PCR反應緩沖液B配制。 串1 撒卓P「R 6 淚會誠的配屮 ' 采用上述配比配制完相應的數字PCR反應混合液后，蓋緊PC