一種用于檢測hbv-b/c的數字pcr絕對定量分型檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子診斷生物學技術領域，具體涉及一種用于檢測HBV-B/C的數字PCR 絕對定量分型檢測試劑盒及其檢測方法。
[0002]
【背景技術】
[0003] 乙型肝炎病毒是導致人類急性和慢性乙型肝炎的病原體，它能引起肝臟細胞的嚴 重損傷，并且持久穩固的HBV感染與肝硬化及肝癌的發生密切相關，對人類的健康危害極 大。據估計，全世界感染過HBV的人數大約有20億，并且超過3.5億的感染者具有持久穩固和 慢性感染;每年因 HBV感染導致的相關疾病死亡人數可達60萬-100萬。HBV在世界各地的流 行感染率差別極大，在亞洲東部地區HBV的感染流行率最高，而在北美和歐洲的西北部地區 流行率很低。中國HBV感染人數超過7億，其中約1.2億攜帶者，3000萬慢性感染者，每年新增 HBV感染人數約50萬，是世界上HBV感染率最高的國家之一。
[0004] 不同HBV基因型可以導致不同的臨床表現及預后。有研究表明基因 B型感染者較C 型感染者較少發生肝損害，且基因 B型感染者較C型不易發展至肝硬化、炎癥程度較輕;基因 C型感染者其肝臟炎癥壞死評分高于基因 B型感染者，基因 C型感染者容易發展為肝硬化和 肝癌。在中國主要流行HBV-B/C型。因此，HBV基因分型檢測可以在乙肝炎患者的臨床類型、 預后判斷及治療方法的選擇等方面發揮重要的作用。
[0005] 乙型肝炎病毒表面抗原的血清學檢測在HBV感染的診斷中起著重要作用。目前采 用免疫學方法檢測HBV血清學標志物廣泛用于急、慢型感染的診斷、療效觀察和預后判斷。 然而，由于HBV亞型和變異株的存在以及病毒的免疫逃逸，即使在HBV攜帶者血液中，檢測不 到HBs Ag且抗HBs Ag抗體陽性，仍然不能確定該攜帶者體內的HBV已經完全清除，也不能排除 其他將來發生與HBV感染相關的嚴重肝臟疾病并發癥的可能。HBV的血清學診斷是間接診 斷，不能直接反映病原體的存在，故用這些血清學標志物檢測疾病的發展有一定的限制。分 子診斷技術的引入為直接和真實地反映患者體內病毒復制水平，以及判斷患者病情、療效 和預后提供了可能。
[0006] 目前HBV基因分型的分子診斷主要包括核酸雜交法、基因芯片和熒光PCR法等。其 中核酸雜交包括斑點雜交、液相雜交、支鏈DNA技術等方法，但是由于雜交步驟較為繁瑣，在 大樣本研究中耗時較長，易導致交叉雜交反應，而存在著一定的不足;基因芯片由于其成本 較高，制作工藝復雜，而且信號檢測需要專門的儀器設備，限制了其在臨床上的應用。目前 認為實時熒光定量PCR技術是檢測HBV DNA以及分型的最好方法，該技術目前被公認為第二 代定量PCR技術，但其定量需要參考標品、標準曲線和內標校正，對有限的標本材料以及低 拷貝數HBV的準確定量仍存在一定的應用限制。
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【發明內容】
[0008] 針對現有技術存在的上述不足，本發明所要解決的技術問題是：如何提供一種用 于檢測HBV-B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒及其檢測方法，用于克服現有檢測技術 中步驟繁雜、耗時較長、易導致交叉雜交反應、需要進行定量矯正、準確度不高等不足之處， 且具有準確度高、靈敏度高、精確度高、重現性好的特點。
[0009] 為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案:一種用于檢測HBV-B/C的數字 PCR絕對定量分型檢測試劑盒，包括DNA提取液、數字PCR反應緩沖液A、數字PCR反應緩沖液 B、HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽性質控、陰性質控和內標溶液； 所述數字PCR反應緩沖液A中包括有HBV-B型的引物及探針和HBV-C型的引物及探針;所 述數字PCR反應緩沖液B中包括有內標的引物及探針;所述HBV-B型、HBV-C型和內標的引物 及探針如下所示： HBV-B型和HBV-C型通用上游引物： ctagactcgtggtggacttctc； HBV-B型和HBV-C型通用下游引物： atgaggcatagcagcaggat； HBV-B 型探針：tcgcagtcccaaatctccagtcactc; HBV-C 型探針：tcgcagtccccaacctccaatca; 內標上游引物：ctgccgttactgccctgtg; 內標下游引物:ttggtctccttaaacctgtcttg; 內標探針：accaccaacttcatccacgttcacc; 所述HBV-B型探針5'端熒光報告基因為FAM，HBV-C型探針5'端熒光報告基團為VIC，內 標探針5 '端熒光報告基團為VIC，所有探針3 '端淬滅基團均為BHQ; 所述HBV-B病毒基因陽性質控為HBV-B的標準質粒溶液;所述HBV-C病毒基因陽性質控 為HBV-C的標準質粒溶液； 所述陰性質控為滅菌生理鹽水； 所述內標溶液為β-globin的標準質粒溶液。
[0010] 一種用于檢測HBV-B/C的數字PCR絕對定量分型檢測方法，采用上述用于檢測HBV- B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒進行檢測，具體檢測方法包括如下步驟： (1) 受檢樣品處理:將待測樣品用無菌生理鹽水洗滌并離心棄去上清液后，加入滅菌水 震蕩混勻，向震蕩混勻后的溶液中加入所述試劑盒中的DNA提取液和內標溶液，劇烈震蕩混 勾，并于100~105°C恒溫處理10~16分鐘，再于12,000~14,000印111/111；[11離心5~10分鐘，取上清 液，獲得PCR擴增樣品DNA模板； (2) 質控品的處理:分別取所述試劑盒中的HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽 性質控和陰性質控，按照與步驟（1)相同的方法處理，分別得到HBV-B病毒基因陽性質控、 HBV-C病毒基因陽性質控和陰性質控的DNA模板； (3) 配制數字PCR反應混合液：向步驟（1)和步驟(2)處理后得到的樣品DNA模板、HBV-B 病毒基因陽性質控DNA模板、HBV-C病毒基因陽性質控DNA模板和陰性質控DNA模板中分別加 入滅菌水和所述試劑盒中的數字PCR反應緩沖液，分別配制得到樣品、HBV-B病毒基因陽性 質控、HBV-C病毒基因陽性質控和陰性質控的數字PCR反應混合液;其中，陽性質控和陰性質 控的數字PCR反應混合液均采用數字PCR反應緩沖液A配制，樣品的數字PCR反應混合液分為 兩種，分別采用數字PCR反應緩沖液A和數字PCR反應緩沖液B配制； (4) 將步驟(3)制備的樣品、HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽性質控和陰性 質控的數字PCR反應混合液分別制作為油包水PCR微反應液滴，生成的微反應液滴數量為 10，000~20，000個，然后對所述微反應液滴進行PCR擴增反應； (5) 讀取熒光信號:步驟(4)PCR擴增后，將PCR反應板放入熒光讀取儀器中，分別在FAM 和/或VIC通道中進行HBV-B和/或HBV-C的分型檢測，通過Quanta soft軟件進行定量分析， 計算出HBV-B型和/或HBV-C型的拷貝數。
[0011]相比現有技術，本發明的有益效果在于： 1、本發明通過創造性的試驗研究設計出擴增HBV-B型和C型的引物及雙色熒光探針，使 這些引物能夠很好地與模板DNA上目標片段結合，而不會與模板DNA上目標片段以外的區域 結合，具有良好的PCR擴增特異性，進而將這些引物和探針加入數字PCR反應緩沖液中，可以 使樣品的特異性PCR反應產物可以分別在FAM和VIC通道中進行HBV-B和HBV-C的分型檢測， 準確定量出HBV兩種亞型的拷貝數，檢測效果更高、檢測數據結果更加精確。
[0012] 2、本發明用于檢須_V-B/C的數字PCR絕對定量分型檢測方法，基于數字PCR平臺 對HBV-B/C含量進行絕對定量檢測，檢測方法中主要依靠數字PCR技術和雙色熒光探針，檢 測過程不依賴于擴增曲線的閾值(CT)進行定量，不受擴增效率的影響，無需依靠標準曲線 和看家基因來測定核酸量，而是直接采用數字PCR檢測系統通過微滴化處理，使得稀有檢測 片段從大量的復雜背景中分離出來，直接數出DNA分子的個數，大大簡化操作步驟，使該方 法檢測時間僅需要3小時，有效節約了準備時間和檢測時間，且結果判讀直觀可靠，具有可 以穩定實施的特點，檢測靈敏度及精確性都達到精準定量的要求，提高了檢測的靈敏度和 精確性。
[0013] 3、本發明檢測方法在HBV含量極低的組織樣品檢測中，通過微滴化處理可以大大 減少背景和基質的干擾，靈敏度可以低至1個拷貝，而不會受到背景DNA或雜質的干擾，克服 了現有實時熒光定量PCR技術無法精確對低豐度基因進行定量的不足之處。
[0014] 4、本發明試劑盒可以方便地在生物技術公司生產以及在生物醫學檢測機構用于 檢測，具備產業化推廣條件，具有良好的市場前景。
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【附圖說明】
[0016] 圖1為FAM通道檢須_V-B/C引物及探針特異性； 圖2為VIC通道檢測HBV-B/C引物及探針特異性； 圖3為VIC通道檢測HBV-C/B引物及探針特異性； 圖4為FAM通道檢測HBV-C/B引物及探針特異性； 圖5為陰性樣品的熒光檢測結果； 圖6為HBV-B感染樣品的熒光檢測結果； 圖7為HBV-C感染樣品的熒光檢測結果。
[0017]
【具體實施方式】
[0018] 為更好地理解本發明的內容，下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說 明。應該理解，下列具體實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的限制。 一、一種用于檢測HBV-B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒，包括DNA提取液、數字 PCR反應緩沖液A、數字PCR反應緩沖液B、HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽性質 控、陰性質控和內標溶液； 所述DNA提取液包括50mMpH8.3的Tris-HCl，0.5MNaCl，5