[0034] 5VCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGGC-C3-3 7 〇
[0035] 進一步的，所述步驟四中的收集熒光信號的步驟包括:將稀釋好的高低溫內標各1 yL，加入HRM-PCR擴增產物單孔中，于95°C水浴30s; 25°C水浴30s;放入高分辨率熔解曲線分 析系統中收集熒光信號。
[0036] 一種耗牛F0X01基因單核苷酸多態性的檢測試劑盒，包括lOpmol/yL權利要求1所 述的特異性引物對A和特異性引物對B各lyL、18-22ngAxL F0X03基因組DNA lyL、2X Taq PCR MasterMix 12.5yL、滅菌的超純水9.5yL。
[0037] 采用上述技術方案，包括以下有益效果：
[0038] 1、本發明設計了基因探針比現有技術中的HRM法檢測多態性位點定位更加準確、 靈敏，且分型準確不需要PCR后處理，工作效率高、重復性好對樣本的質和量要求不高，尤其 對DNA模板的濃度要求可低至0. lng/yL，尤其樣本量大時，既省時又省力。
[0039] 2、由于F0X01基因對生長發育性狀具有重要生物學功能，為該基因的SNPs與生長 性狀關聯的奠定了基礎。F0X01基因單核苷酸多態性對牦牛、體高、體斜長、胸圍、和管圍有 顯著影響，可用于牦牛肉用和生長性狀的分子標記輔助選擇，進而快速建立遺傳資源優良 的經濟型牦牛種群。
[0040] 3、本發明方法與其他遺傳分型技術相比，操作簡單，具有靈敏度高、特異性好、成 本低、快速、高通量檢測等優點，結果準確。
【附圖說明】
[0041 ]圖1為本發明牦牛F0X01基因 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0042]圖2為本發明PCR擴增產物測序峰圖；
[0043]圖3為本發明F0X01基因單核苷酸多態位點的HRM分型曲線圖。
【具體實施方式】
[0044]下面通過具體的實施例并結合附圖對本發明做進一步的詳細描述。
[0045]實施例一:一種耗牛F0X01基因單核苷酸多態性的檢測方法，包括以下步驟：
[0046]制備牦牛F0X01基因 PCR擴增產物：首先提取耗牛血液基因組DNA，將其稀釋后，以 F0X01基因的待測牦牛全基因組DNA為模板，以特異性引物對A和特異性印務B為引物，用PCR 法擴增牦牛F0X01基因，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用純化試劑盒純化PCR擴增產物，進 行測序并根據測序結果鑒定牦牛F0X01基因第720位的單核苷酸多態性（發生了C-T的突 變)。
[0047] 具體步驟如下：
[0048]步驟一：制備牦牛F0X01基因擴增產物：首先提取耗牛血液基因組DNA，將其稀釋 后，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計雙重檢測DNA的質量，使用已檢測提取的DNA并 抽取20yL稀釋到18-22ngAiL，作為PCR擴增模板，其余保存于-80°C，隨機抽取200份稀釋后 的DNA樣品，每個樣品各取lyL，混合均勻，構成基因組DNA混合池參考GenBank中發表的牦牛 的F0X01基因序列（登錄號分別為:M91_10071)運用Primer Primer 5.0與Oligo 7等引物設 計軟件設計2對引物，即特異性引物對A和特異性引物對B，對部分外顯子區域進行擴增，弓丨 物由上海生工生物有限公司合成；
[0049] PCR 反應體系 25yL:基因組DNA( 18-22ngAxL) lyL，上、下游引物（lOpmo 1)各 lyL， 2X Taq PCR MasterMix 12.5yL，滅菌的超純水9·5υ〇?反應程序:95°C預變性3min，94°C 變性30s，復性30s，退火溫度見表1，72°C延伸30s，35個循環，72°C延伸10min，4°C保存。將得 到的PCR擴增產物經過瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化;取純化后PCR擴增產物測序，找出單核 苷酸位點；
[0050]所述特異性引物對A為：
[0051 ]上游引物：5' AGAGGGAGGCAAGAGTGG 3';
[0052]
[0053]所述特異性引物對B為：
[0054]
[0055] 下游引物：5' GGACAGACTAGGCAGAGTAGAA 3'。
[0056] 述特異性引物對A長度為702bp，其PCR擴增位置為165-866，所述特異性引物對B長 度為371bp，其PCR擴增位置為161-531。
[0057] 表1 F0X01 CDS區引物信息 [0058]
[0060] 步驟二：合成高低溫內標：取步驟一純化后PCR擴增產物測序，測序結果經過 DNAman、DNAs tar 和Chromas軟件進行對比分析，利用Light Scanner primer design software設計出用于高分辨率恪解曲線(High resolution melting，HRM)分析高分辨率恪 解曲線分析耗牛F0X01基因單核苷酸多態位點的DNA探針，進行基因型分析，合成高低溫內 標，并對恪解曲線進彳丁 fe正，提尚分型的精確度;耗牛F0X01基因單核昔酸多態位點的DNA探 針核苷酸序列見表2;
[0061] 表2 HRM分析多態位點的探針信息
[0062]
[0063] 高低溫內標的核苷酸序列件表3;
[0064] 表3高低溫內標序列
[0065]
[0066]
[0067] 步驟三：制備HRM-PCR擴增產物:取F0X01基因的基因組DNA，加入耗牛F0X01基因單 核苷酸多態位點的DNA探針，進行HRM-PCR擴增，HRM-PCR擴增體系11 yL:基因組DNA (18-22ng/yL)lyL，上、下游引物（lOpmol/yL)各lyL，2X Taq PCR MasterMix 5yL，LC green飽和 染料lyL，滅菌的超純水2yL ARM-PCR反應程序:95°C預變性5min，94°C變性20s，復性20s退 火溫度55°C，72°C延伸20s，35個循環，72°C延伸lOmin，4°C保存，得到HRM-PCR擴增產物；
[0068] 步驟四：收集熒光信號：將步驟二合成的高低溫內標稀釋，稀釋方法為：高低溫內 標稀釋方法：l〇D內標單鏈加400yL雙蒸水。退火體系:飽和氯化鈉 lyL，內標互補雙鏈各lyL， 補水至10yL，95°C水浴3min，然后緩慢降至室溫；
[0069]將稀釋好的高低溫內標各lyL，加入HRM-PCR擴增產物單孔中95°C水浴30s; 25°C水 浴30s;放入LightScanner 96高分辨率熔解曲線分析系統中收集熒光信號，通過不同的熒 光檢測結果確定檢測SNP位點處堿基突變的基因型。
[0070] 一種耗牛F0X01基因單核苷酸多態性的檢測試劑盒，包括lOpmol/yL權利要求1所 述的特異性引物對A和特異性引物對B各lyL、18-22ngAxL F0X03基因組DNAlyL、2X Taq PCR MasterMix 12.5yL、滅菌的超純水 9.5yL。
[0071] 實施例二:數據統計
[0072] 據群體遺傳學理論計算得到基因型和等位基因頻率，統計牦牛群體F0X01基因多 態位點的純和度（Ho)、雜合度（He)、有效等位基因數（Ne)和多態信息含量（PIC)。進行 Hardy-Weinberg平衡定律進行平衡檢驗，采用SHEsis軟件進行配對連鎖不平衡分析。采用 SPSS17.0軟件對F0X01基因多態性位點在牦牛群體中的基因型分布進行卡方檢驗，并對不 同基因型與體尺性狀間的關聯性進行分析。
[0073]實施例三:結果分析
[0074] PCR擴增產物：以牦牛血液基因組DNA為模板，用所設計的引物進行PCR特異性擴 增，結果見圖1，圖1中：圖1中1，2分別代表引物F0X01、F0X02; Μ代表Mark。由圖1可知，PCR擴 增產物均為單一特異性條帶，與預期大小基本一致。對上述特異性引物對A和特異性引物對 B進行測序，結果顯示如圖2所示，F0X01基因的部分⑶S區序列存在720(C/T) 1