一種耗牛foxo1基因單核苷酸多態性的檢測方法及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[00011本發明涉及基因多態性檢測技術領域，具體涉及一種耗牛F0X01基因單核苷酸多 態性的檢測方法及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] F0X01是F0X0家族的成員之一，作為轉錄因子，其通過翻譯后修飾等方式調節下游 靶基因轉錄，參與氧化應激、凋亡、DNA損傷修復、細胞周期阻滯等生物學過程，。目前F0X01 基因作用機制尚未完全闡明，針對F0X01基因研究已成為當今研究熱點。對F0X01基因進行 定性分析有助于對F0X01基因的進一步研究。
[0003] 單核苷酸多態性(SNP)是基因組中發生頻率最高的變異種類。研究SNP可促進人們 對基因組結構、基因的進化歷史及疾病發生根源的了解。SNP是種群遺傳分析、疾病發生機 理和藥物研發等領域的重要研究對象。目前，針對SNP研究所建立的數據庫和高效、精確、方 便操作的工具，對于展現SNP在引領遺傳分析、疾病診治等領域發展方面的重要性具有很高 的利用價值。
[0004] 單核苷酸多態性（singlenucl eoti depolymorph ism，SNP)是指相同或不同物種個 體的基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現象。其中多態性 (polymorphism)指的是形態多樣性和狀態多樣性，在這里是基因水平上的多態性，指一個 基因座位上存在多個等位基因，它是基因組中發生頻率最高的點突變，在已知DNA的多態性 中占了大約90 %。同時，也發現每1000個堿基中就有一個會發生變異，它在一個種群中的發 生率至少在1 %水平。因此，具體地說，SNP指的是基因組序列中單核苷酸(A、T、C和G)改變時 所發生的DNA序列的多態性變化，即基因組內特定的核苷酸位置上存在2種或更多不同的堿 基，其中最少一種在群體中的頻率不低于1 %。
[0005] 多態性(SNP)位點的經典方法是一大類以凝膠電泳為基礎的一系列傳統方法，包 括:限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)，此方法應用的前提是SNP位點必須含有限制性內 切酶的識別位點，但此方法是SNP位點篩查中最經典的方法之一;單鏈構象多態性法(PCR-SSCP)，該方法簡單快速，被廣泛運用與未知基因突變的檢測，但這種方法對溫度要求嚴格 且不能確定突變的類型及突變的具體位置，因而帶有一定的盲目性。變性梯度凝膠電泳 (DGGE)，多用于分析自然環境中細菌類和、真核生物和病毒等生物的多樣性。此方法具有可 重復和操作簡單等特點，但此法會受到DNA分子互補鏈中氫鍵的含量的影響，因此很少用于 SNP位點的檢測分析;等位基因特異性PCR法(ASPCR)。
[0006] 而現有的一些新型SNPs高通量檢測方法包括:高效液相色譜法(DHPLC)法;基因芯 片法及DNA直接測序法。其中DHPLC法檢測效率高便于自動化的優點，且準確率高，但DHPLC 對所用試劑和環境要求高，易產生誤差。基因芯片法具有信息量大、自動化程度高的特點， 但芯片造價成本昂貴，所需設備貴重，所以不利于普及應用。而DNA直接測序法突變位點檢 出率高、速度快，擺脫了傳統的凝膠電泳所對溫度的要求，且對其類型和位置分析準確，帶 有目的性，成本相對低，利于廣泛應用于檢測SNP位點。
[0007] 目前現有技術中針對F0X01基因遺傳變異的研究較少，該基因位點的功能研究及 其遺傳變異與經濟性狀關聯的研究仍是空白，且現有針對F0X01基因單核苷酸多態性的檢 測多存在探針與目標序列存在錯配堿基的問題，這樣，就會大大減少探針與目標序列結合 的緊密度，影響探針的熒光釋放量，導致檢測結果不準確。由此可見能否提供一種耗牛 F0X01基因單核苷酸多態性的檢測方法，有效實現耗牛F0X01基因單核苷酸多態性的檢測， 且具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優點，成為本領域技術人員亟待解 決的技術問題。
【發明內容】
[0008] 本發明為了解決上述技術問題，提供一種耗牛F0X01基因單核苷酸多態性的檢測 方法及其試劑盒，該方法具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優點。
[0009] 為了達到上述技術效果，本發明包括以下技術方案：
[0010] 一種耗牛F0X01基因單核苷酸多態性的檢測方法，包括以下步驟：
[0011]步驟一：制備牦牛F0X01基因擴增產物：首先提取耗牛血液基因組DNA，將其稀釋 后，以基因組DNA為模版，以牦牛F0X01基因序列設計特異性引物對A和特異性引物對B，進行 PCR擴增耗牛F0X01基因，得到PCR擴增產物后純化;取純化后PCR擴增產物測序，找出單核苷 酸位點；
[0012]步驟二:合成高低溫內標:通過高分辨率熔解曲線分析耗牛F0X01基因單核苷酸多 態位點的DNA探針，進行基因型分析，合成高低溫內標，并對恪解曲線進行校正；
[0013] 步驟三：制備HRM-PCR擴增產物：取F0X01基因的基因組DNA，加入步驟二所述的耗 牛F0X01基因單核苷酸多態位點的DNA探針，進行HRM-PCR擴增，得到HRM-PCR擴增產物；
[0014]步驟四：收集熒光信號:將步驟二合成的高低溫內標稀釋，并與步驟三制備的HRM-PCR擴增產物混合，于高分辨率熔解曲線分析系統中收集熒光信號，通過不同的熒光檢測結 果確定檢測SNP位點處堿基突變的基因型。
[0015]進一步的，所述特異性引物對A為：
[0016] 上游引物:5' AGAGGGAGGCAAGAGTGG 3';
[0017] 下游引物：5' ATGTCGTTGTGCGGAGGA 3';
[0018] 所述特異性引物對B為：
[0019] 上游引物:5' ATCCAGAGGGAGGCAAGA 3';
[0020] 下游引物:5' GGACAGACTAGGCAGAGTAGAA 3'。
[0021 ]進一步的，所述特異性引物對A擴增長度為702bp，其PCR擴增位置為165-866,所述 特異性引物對B擴增長度為371bp，其PCR擴增位置為161-531。
[0022] 進一步的，所述PCR擴增的反應程序為:95°C預變性3min，94°C變性30s，復性30s， 特異性引物對A擴增退火溫度為61°C，特異性引物對B擴增退火溫度為62°C，72°C延伸30s， 35個循環，72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0023]進一步的，所述步驟二中的耗牛F0X01基因單核苷酸多態位點的DNA探針核苷酸序 列為：針對F0X01基因720C/T位點的上游探針：5' CCCTGCTACTCCTTTGC 3';針對F0X01基因 720C/T位點的下游探針:5' CATGCCTCCATAACTCG 3'。
[0024] 進一步的，所述步驟三的HRM-PCR擴增的反應程序為：95°C預變性5min，94°C變性 20s，復性20s退火溫度55°C，72°C延伸20s，35個循環，72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0025] 進一步的，所述步驟四中的高低溫內標稀釋的方法包括以下步驟:10D內標單鏈加 400yL雙蒸水，退火體系為：飽和氯化鈉 lyL內標互補雙鏈各lyL，補水至10yL，95°C水浴 3min，溫度降至室溫，得到稀釋后的高低溫內標。
[0026] 進一步的，所述高低溫內標的核苷酸序列為：
[0027]退火溫度為57°C的低溫I內標：
[0028] 57 GTATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3-37 ；
[0029]退火溫度為53°C的低溫II內標：
[0030] 57 TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTAATATATAAATATAATAC-C3-37 ；
[0031 ]退火溫度為86°C的高溫I內標：
[0032] 5'GCCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3-3 7 ；
[0033] 退火溫度為86°C的高溫II內標：