反應的產率，引入七種濃度為0.8g/mL的咪唑類離子液體和四種濃度為 0.8g/mL的季銨鹽離子液體作為反應體系共溶劑，其中七種咪唑類離子液體為:溴化-1-乙 基-3-甲基咪唑^1?頂][84、溴化-1-丙基-3-甲基咪唑[?]\〇]\1][8^、溴化-1-丁基-3-甲基咪 唑[BMM][Br]、溴化-1-戊基-3-甲基咪唑[AMM][Br]、氯化-1-乙基-3-甲基咪唑[EMM] [Cl]、l-丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸[PMIM][PF6]、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸[EMIM] [BF 4];四種季銨鹽離子液體為：四甲基溴化銨(TMAB)、四乙基溴化銨(TEAB)、四丙基溴化銨 (TPAB)、四丁基溴化銨(TBAB)。
[0045] 在反應體系中加入2.5mL的0. lmol/L磷酸緩沖溶液和占磷酸緩沖溶液體積2%的 共溶劑離子液體溶液，其他條件同實施例1，考察離子液體種類對底物的轉化率，2，3-環氧 蒎烷產率的影響。結果如圖1所示，其中，咪唑類的離子液體效果最好，陰離子為溴離子與氯 離子時產率相差不多，優于陰離子為六氟磷酸與四氟硼酸，離子液體的陽離子基團大小不 同，其作用效果也不盡相同，引入[EMm][Br]效果最好，說明離子液體陽離子基團越小越有 利于酶促反應的進行，2，3-環氧蒎烷的產率提高越多。
[0046] 實施例5
[0047] 考察了離子液體[EMIM] [Br]的用量對2，3-環氧蒎烷產率的影響，磷酸緩沖溶液 (PBS)用量范圍2~3mL，離子液體共溶劑與磷酸緩沖溶液(PBS)的體積比V W_/VPBS = 0.1 % -3%，其他條件不變。結果如圖2所示，隨著[EiOM][Br]濃度的增大，2,3-環氧蒎烷的產率逐 漸增大，當濃度增加到一定量時，產率又逐漸減小，可見酶對離子液體的耐受濃度有個最大 值，當引入^1頂][8幻濃度為1.33%(￥ 1^/^他(^)時，2,3-環氧蒎烷的產率達到最大 86.46 %，底物轉化率100 %。
[0048] 對比例1
[0049] 由于CP0為親水性的酶，降冰片烯為疏水性底物，為了增加底物的溶解性，實施例4 中引入離子液體；因為有機溶劑的添加也可以增加底物溶解度。對比加入50uL的離子液體 溶液和50uL的有機溶劑，觀察對2，3-環氧蒎烷產率的影響。在此反應中，有機溶劑與離子液 體起到兩個作用：一是增加了有機底物的溶解度，可以與CP0更好的發生反應，提高反應的 產率;二是由于CP0活性中心是深埋在血紅素內部的，需要經過一個底物通道才能與活性中 心接觸，加入共溶劑以后使CP0的底物通道暴露程度增大，也就是活性中心卟啉環的暴露程 度增加。
[0050] 根據有機溶劑的極性參數選擇了四種有機溶劑(正己烷(0.06)、甲醇(6.6)、1，4_ 二氧六環(4.8)、乙腈(6.2))作為反應體系的共溶劑，取有機溶劑50uL，其他條件不變，考察 了不同有機溶劑對該環氧化反應底物的轉化率，2,3_環氧蒎烷產率及選擇性的影響，其中， 在乙腈中的產率最高為80%，底物轉化率88.6%，而[EMIM] [Br]離子液體的產率為 86.46%，底物轉化率100%，結果表明，相對有機溶劑，本發明添加的離子液體不僅作為綠 色的共溶劑，而且其添加效果優于有機溶劑。
[0051 ] 對比例2
[0052]純緩沖液體系及添加少量離子液體、季銨鹽體系與有機溶劑體系的CP0催化氧化 降冰片烯體系分別的米氏常數心，轉化數列于表1。1^的增大是添加季銨鹽后 時產率提高的主要原因。而米氏常數Km的減小則表明CP0對底物降冰片烯的親和力不斷增 大。同時，k cat/Km的增大說明這些共溶劑能夠提高CP0的對底物識別的專一性。其中添加 [EMIM] [Br]的酶促反應的轉化數kcat最大，米氏常數Km最小，kcat/K m增大最多，表明其增敏效 應最強。
[0053]本發明設計了一條制備過程簡單、成本低廉、綠色環保、高效的2,3_環氧蒎烷的合 成路線。考察了氧化劑的添加方式對環氧化反應的影響，并探索最佳條件，對CPO催化H2〇2氧 化合成2，3-環氧蒎烷的影響因素分別進行優化，使反應速率和產率達到最高。
[0054]表1磷酸緩沖溶液(PBS)中與引入離子液體、季銨鹽與有機溶劑時CP0催化環氧化 降冰片烯反應動力學參數
[0055]
[0056] 實施例6
[0057] 將2.5uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、120uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃 度為1.2umol/L的CP0和40uL濃度為0.8g/mL的溴化-1-丙基-3-甲基咪唑離子液體，加入 0. lmol/L的pH = 4.5的磷酸緩沖溶液混合得到反應體系，使反應體系的總體積為3mL，反應 溫度為30°C，反應lh。
[0058] 實施例7
[0059] 將4uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、180uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃度 為0.9umol/L的CP0和45uL濃度為0.8g/mL的四乙基溴化銨離子液體，加入0. lmol/L的pH= 5 的磷酸緩沖溶液混合得到反應體系，使反應體系的總體積為3mL，反應溫度為25°C，反應2h。 [0060] 實施例8
[0061 ] 將7.5uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、100uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃 度為1.5umol/L的CP0和55uL濃度為0.8g/mL的四丁基溴化銨離子液體，加入0. lmol/L的pH =5.5的磷酸緩沖溶液混合得到反應體系，使反應體系的總體積為3mL，反應溫度為40°C，反 應3h。
[0062] 實施例9
[0063] 將6uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、200uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃度 為0.8umol/L的CP0和60uL濃度為0.8g/mL的氯化-1-乙基-3-甲基咪唑離子液體，加入 0. lmol/L的pH = 5的磷酸緩沖溶液混合得到反應體系，使反應體系的總體積為3mL，反應溫 度為50°C，反應4h。
【主權項】
1. 一種酶促反應制備2,3-環氧蒎烷的方法，其特征在于，包括以下步驟:取降冰片烯、 雙氧水和氯過氧化物酶溶液加入磷酸緩沖溶液，混合形成反應體系進行反應，在反應體系 中，降冰片烯、H2〇2、氯過氧化物酶和磷酸緩沖溶液的摩爾比為(0.005~0.015)umol:(10~ 20)umol: (12~30)X10-6umol: (2~3)mL〇2. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2，3-環氧蒎烷的方法，其特征在于，所述雙 氧水的濃度為0.lmol/L。3. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2，3-環氧蒎烷的方法，其特征在于，所述氯 過氧化物酶溶液的濃度為〇 · 6~1 · 5umol/L〇4. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2,3_環氧蒎烷的方法，其特征在于，磷酸緩 沖溶液的濃度為O.lmol/L。5. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2,3_環氧蒎烷的方法，其特征在于，磷酸緩 沖溶液的pH值為3.5~6。6. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2，3-環氧蒎烷的方法，其特征在于，在反應 體系中還添加有濃度為0.8g/mL的離子液體共溶劑，其中，離子液體共溶劑的體積占磷酸緩 沖溶液體積的0.1~3 %。7. 根據權利要求6所述的一種酶促反應制備2，3-環氧蒎烷的方法，其特征在于，離子液 體采用咪唑類離子液體或季銨鹽類離子液體。8. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2,3_環氧蒎烷的方法，其特征在于，雙氧水 是間歇式加入，間歇時間是30min。9. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2，3-環氧蒎烷的方法，其特征在于，反應溫 度為0~60°C。10. 根據權利要求1所述的一種酶促反應制備2，3-環氧蒎烷的方法，其特征在于，反應 時間為1~6h。
【專利摘要】本發明涉及一種酶促反應制備2,3-環氧蒎烷的方法，包括以下步驟：取降冰片烯、雙氧水和氯過氧化物酶溶液加入磷酸緩沖溶液，混合形成反應體系進行反應，在反應體系中，降冰片烯、H2O2、氯過氧化物酶和磷酸緩沖溶液的摩爾比為(0.005～0.015)umol：(10～20)umol：(12～30)×10-6umol：(2～3)mL。本發明通過CPO作為催化劑，雙氧水作為氧化劑，催化高級烯烴——降冰片烯進行環氧化反應合成2,3-環氧蒎烷，操作簡單、快速高效、酶及氧化劑用量極少、反應溫度較低、產率較高、選擇性高，本發明采用酶促反應制備2,3-環氧蒎烷，克服了現有方法在有機溶劑中進行的問題，綠色環保。
【IPC分類】C12P17/02
【公開號】CN105441503
【申請號】CN201510969691
【發明人】蔣育澄, 王鳳嬌, 胡滿成, 李淑妮, 翟全國
【申請人】陜西師范大學
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月21日