一種酶促反應制備2,3-環氧蒎烷的方法
【專利說明】一種酶促反應制備2,3-環氧蒎烷的方法 【技術領域】
[0001] 本發明屬于綠色合成領域，具體涉及一種酶促反應制備2,3_環氧蒎烷的方法。 【【背景技術】】
[0002] 2,3_環氧蒎烷是一種重要的有機合成中間體，用于合成一系列香料如香芹醇、龍 腦烯醛及生物活性物質如保幼激素類似物、昆蟲驅避劑等。其作為重要的精細化工品的中 間體，被人們廣泛的研究，目前針對2,3_環氧蒎烷的合成方法主要是通過烯烴環氧化方法 制備，以α_蒎烯為反應物，分子篩或介孔分子作催化劑，過氧化氫或過氧乙酸作氧化劑的化 學方法進行合成，但這些方法存在手性識別能力差，導致選擇性不夠高，環境污染問題等， 近年來使用過渡金屬配合物催化體系研究較多，雖然合成方法開始向綠色化學轉化，但是， 這些反應仍然在有機溶劑體系中進行，使用的催化劑制備過程很復雜，且有些使用的是有 機物作為氧化劑，會對環境造成污染，不符合綠色化學的要求。
[0003] 從綠色發展的角度來看，模擬生物酶催化是一個高效的方法，氯過氧化物酶(CP0) 是從海洋真菌Caldariomyces fumago中提取出來的一種血紅素過氧化物酶(42kDa) <ΧΡ0具 有極為廣泛的氧化活性，兼具血紅素過氧化物酶(單電子及兩電子過氧化、有機鹵化）、過氧 化氫酶(過氧化氫歧化、一元醇氧化）以及細胞色素 Ρ450 (脫烷基化、烯鍵環氧化、磺化氧化 等)等多種酶的催化特征，目前被認為是過氧化物酶家族中應用最廣泛的酶。 【
【發明內容】
】
[0004] 本發明的目的在于克服現有技術中存在的問題，提供一種酶促反應制備2,3_環氧 蒎烷的方法，該方法選擇性高，無污染。
[0005] 本發明的技術方案是：
[0006] 包括以下步驟:取降冰片烯、雙氧水和氯過氧化物酶溶液加入磷酸緩沖溶液，混合 形成反應體系進行反應，在反應體系中，降冰片烯、Η 202、氯過氧化物酶和磷酸緩沖溶液的摩 #KS(0.005~0.015)umol:(10~20)umol :(12~30)X10-6umol:(2~3)mL〇
[0007] 進一步地，所述雙氧水的濃度為0. lmol/L。
[0008] 進一步地，所述氯過氧化物酶溶液的濃度為0.6~1.5umol/L。
[0009] 進一步地，磷酸緩沖溶液的濃度為0. lmol/L。
[0010] 進一步地，磷酸緩沖溶液的pH值為3.5~6。
[0011] 進一步地，在反應體系中還添加有濃度為0.8g/mL的離子液體共溶劑，其中，離子 液體共溶劑的體積占磷酸緩沖溶液體積的〇. 1~3%。
[0012] 進一步地，離子液體采用咪唑類離子液體或季銨鹽類離子液體。
[0013] 進一步地，雙氧水是間歇式加入，間歇時間是30min。
[0014] 進一步地，反應溫度為0~60°C。
[0015] 進一步地，反應時間為1~6h。
[0016] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0017] 本發明通過CP0作為催化劑，雙氧水作為氧化劑，催化高級烯烴一一降冰片烯進行 環氧化反應合成2，3_環氧蒎烷，CP0用量極少，反應時間為3h時，降冰片烯的轉化率可達 100%，2,3_環氧蒎烷產率可達到86.46%。該方法操作簡單、快速高效、酶及氧化劑用量極 少、反應溫度較低、產率較高、選擇性高、綠色環保。本發明采用酶促反應制備2,3_環氧蒎 烷，克服了現有方法在有機溶劑中進行的問題。
[0018] 進一步地，本發明中還引入離子液體作為共溶劑，與有機溶劑作為共溶劑相比，本 發明有效增加底物的溶解度，從而提高底物轉化率，產率及選擇性；而且離子液體綠色環 保。 【【附圖說明】】
[0019] 圖1是本發明不同離子液體對降冰片烯環氧化的影響；
[0020] 圖2是本發明離子液體濃度對降冰片烯環氧化的影響。 【【具體實施方式】】
[0021 ]本發明制備方法的技術方案包括以下步驟:純緩沖液體系及添加少量離子液體、 季銨鹽與有機溶劑體系。
[0022] 1)緩沖溶液的配制
[0023] O.lmol · L-1磷酸鹽緩沖液：稱量6.8046g KH2P〇4定容于500mL的容量瓶，配成 0.1111〇1.1/11〇12?04溶液；稱量11.411(^1(2邢04定容于50011^的容量瓶，配成0.1111〇1·!/ iHPCk溶液，用K2HP〇4對KH2P〇4溶液調節成pH = 5.8的緩沖液，再用0. lmol · L-1鹽酸將其調 節成所需的不同pH的緩沖液。
[0024] 2)酶催化反應
[0025] (1)將2mmol/L的底物2 · 5~7 · 5uL(降冰片烯），0 · lmol/L的H2O2IOO~200uL，0 · 6~ 1.5umol/L的CP0 20uL，加入2~3mL的0. lmol/L磷酸緩沖溶液(pH = 3.5~6)混合得到反應 體系，通過計算，降冰片烯、H2〇2、氯過氧化物酶和磷酸緩沖溶液的比例為(0.005~0.015) 〇1:(10~20)11111〇1 :(12~30)\10-611111〇1:(2~3)1111^反應溫度為0~60°(3，反應1~611。反應 以加入雙氧水引發，加入方式采用每隔30min分批加入上述反應體系，反應過程使用氣相色 譜監測，在一定的時間間隔內取出反應液，用乙酸乙酯稀釋，一定量的MgS0 4干燥水分，加入 內標物正辛烷，用濾膜過濾后進行色譜分析，底物的轉化率與產物的產率利用實驗前做好 的標準曲線分析。
[0026] (2)本發明還可以在配制（1)的反應體系過程中，先加入濃度為0.8g/mL的離子液 體共溶劑(〇. 8g的離子液體溶于10mL水配制的共溶劑），其中離子液體共溶劑的體積與磷酸 緩沖溶液體積比Vws^/VpbsiO. 1~3% ;通過添加有機溶劑來與添加離子液體進行對比，其 中有機溶劑可以采用正己烷、甲醇、1，4_二氧六環、乙腈，且其與氯過氧化物酶的體積摩爾 比為(40~60)uL:12X10- 6umol;然后再加入0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH = 3.5~6)混合，其 它底物、雙氧水和CP0等用量及步驟同上述(1)。
[0027] 3)酶促反應動力學參數測定
[0028] 降冰片稀的CP0催化環氧化反應符合Michaelis-Menten動力學特征，選擇不同的 底物濃度[S](底物濃度范圍：0.050-0.50mol · I/1)在一定時間內進行反應，根據 lineweaver-burk雙倒數法求出米氏常數Km和最大速率Vmax:以及轉化數，添加離子液體的 情況也一樣，離子液體濃度為其最佳濃度。
[0029]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035] 下面結合具體的實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。 [0036]在緩沖溶液體系中，考察了氧化劑H202的添加方式(一次性加入與間歇式）、不同pH 的磷酸鹽緩沖液化11 = 3.5、4、4.5、5、5.5、6)、反應溫度〇 = 0~70°〇等因素對2,3-環氧蒎 烷產率的影響。
[0037] 實施例1
[0038]由于當雙氧水的濃度過高時，會破壞CP0血紅素的結構，對2,3_環氧蒎烷產率的影 響很大，考察H2〇2(濃度為O.lmol · I/1)分別采用一次性加入與間歇式的添加方式使得總加 入量為150uL，2mmol/L的底物（降冰片烯）5uL，20uL 0.6umol/L的CP0,加入一定量的 0. lmol/L pH= 5.5磷酸緩沖溶液混合使反應體系總體積為3mL，反應在35°C進行，反應時間 為6h。實驗結果表明，每隔30min添加20~30uL的H 2〇2的效果最好，2，3-環氧蒎烷產率與選擇 性最尚。
[0039] 實施例2
[0040] 考察了不同？!1的磷酸鹽緩沖液，？!1=3.5、4、4.5、5、5.5、6對2,3-環氧蒎烷產率的 影響，其中H2〇2采取間歇式加入，其它條件同實施例1不變，產率隨pH增大先增大后降低，在 緩沖溶液pH為5.5時，2，3-環氧蒎烷的產率達最高值為45.07 %，由于在酸度很高時，降冰片 烯環氧化生成的環氧化物容易發生開環反應或者是進一步的氧化反應，生成醇或者相應的 酮，從而使產率降低，而在接近中性條件時，CP0會失活。
[0041 ] 實施例3
[0042] 考察了反應溫度T = 0~70°C對2，3-環氧蒎烷的影響，磷酸緩沖溶液pH為5.5，其他 條件同實施例1，在30°C時降冰片烯的轉化率達到62.57 %，溫度繼續升高時產率下降，因為 溫度升高時2，3-環氧蒎烷的水解程度增大，在40°C與60°C之間變化不大，而溫度達70°C時， 使得CP0失活導致產率急劇下降。
[0043] 實施例4
[0044] 為了提高