到后，將孔內液體甩干，用300 μ L/孔的洗滌工作液洗板，充 分洗滌4~5次，每次間隔10s，甩干液體，用吸水紙拍干；
[0136] 7.顯色：加入100 μ L/孔的TMB顯色液，輕輕振蕩混勾，于室溫（25°C )避光反應 15分鐘；
[0137] 8.終止及讀數：加入50 μ L/孔的終止液，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處， 測定每孔0D值。
[0138] 9.結果判定：
[0139] i).粗略判定：由樣品孔的吸光率與標準品孔的吸光率的簡單對比而來判定：樣 品孔的顏色比某一標準品孔的顏色淺則樣品中萊克多巴胺的濃度比該孔所含標準品的濃 度高，樣品孔的顏色比某一標準品孔的顏色深則樣品中萊克多巴胺的濃度比該孔所含標準 品的濃度低；
[0140] ii).定量分析：以標準品的吸光度平均值與第一個標準（Oppb)的吸光度值的百 分比為縱坐標，以萊克多巴胺標準品的濃度（ppb)的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣 本的吸光度平均值與第一個標準（Oppb)的吸光度值的百分比代入標準曲線中，從而計算 出樣本中萊克多巴胺的實際濃度。
[0141] 實施例7.本發明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒的件能鑒宙
[0142] 本實施案例將本發明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒與市售同類試劑盒進行檢測 性能的比較。
[0143] 兩種試劑盒分別檢測70份新鮮陰性尿液樣本及70份新鮮陽性尿液樣本（新鮮陰 性尿液樣本中加入lppb萊克多巴胺）。本發明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒按照上述檢測 方法進行操作；市售同類試劑盒按照試劑說明書進行操作。檢測結果見下表，兩種檢測試劑 盒均無假陽性的出現；陽性樣本檢測中，本發明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒的回收率范 圍較市售試劑盒更窄，反映出更高的準確性，具備檢測更準確的優勢。
[0144]
[0145] 實施例8.本發明萊克多巴胺膠體金檢測試紙卡的制備
[0146] 本試紙卡應用競爭抑制免疫層析，可用以動物體液中萊克多巴胺的定性檢測，尤 其適用于豬尿液中萊克多巴胺的定性檢測，檢測限為3-5ppb。具體制備方法如下：
[0147] 1. K07抗萊克多巴胺抗體的膠體金標記：
[0148] 用0. 2M K2C03調節膠體金pH值至8. 15,向膠體金溶液中緩慢加入以0. 02M的PBS 稀釋的K07抗體至10ug/mL，低速攪拌30分鐘；
[0149] 加入封閉劑：加入BSA至其終濃度為1 % (質量百分比），攪拌10分鐘后繼續加入 PEG2000至其終濃度為0.05% (質量百分比）；
[0150] 膠體金復溶：攪拌10分鐘后加入與膠體金相同體積的復溶液（1% BSA+5%蔗糖 +0. 1% Tween20+25mM PBS緩沖液（pH7. 5))，于2~8°C靜置過夜。所得即為膠體金標記的 K07抗體；
[0151] 2.用上述膠體金標記的K07抗體噴涂于金標墊6內，將包被抗體稀釋液（3 %甲醇 +25mM PBS緩沖液（pH7. 5))稀釋后的鼠抗His抗體、Rac-OVA偶聯物分別在硝酸纖維素膜 2上劃線于C線4、T線5,再將樣片墊1金標墊6、硝酸纖維素膜2、吸收墊3按附圖8所示 兩兩相鄰并部分層疊從左至右依次粘貼于襯板7上，裝條。
[0152] 本領域技術人員知曉，由于萊克多巴胺為小分子化合物，通常需偶聯大分子載體 蛋白后再用作包被，本實施例所用于偶聯萊克多巴胺的卵清白蛋白（0VA)也可以用牛血清 白蛋白（BSA)、鑰孔血藍蛋白（KLH)等載體蛋白替代。
[0153] 3.將試紙卡與說明書、滴管一起放入紙盒，儲存于4~30°C陰涼避光處，檢驗合格 后貼檢封簽。
[0154] 4.本發明曾嘗試多種試紙卡制備方法，下表展示幾種不同制備方式（表中未列出 的步驟、參數等同本實施例所述）及相應試劑盒的檢測性能。
[0155]
[0156] 實施例9.本發明萊克多巴胺膠體金檢測試紙卡的伸用
[0157] 1.樣品前處理：清亮尿液樣本可直接用于測定，渾濁尿液須先離心（多3000g)以 獲得上清；
[0158] 2.將試紙卡從冷藏環境中取出，置于室溫（25°C )平衡；
[0159] 3.將塑料卡平放，用滴管吸取待檢樣品，垂直滴加3滴（約75 μ L)于加樣孔中；
[0160] 4.液體流動時開始計時，5~10分鐘內讀取結果。
[0161] 5.結果判定：如Τ線無顯色、C線顯色，則判定樣品為陽性，表示樣品中含有高于檢 測限的萊克多巴胺；如Τ線和C線都顯色，則判定樣品為陰性，表示樣品中無萊克多巴胺或 萊克多巴胺的濃度低于檢測限；如C線不顯色，則表明操作不正確，或本次使用的試紙卡已 經失效。
[0162] 實施例10.本發明萊克多巴胺膠體金檢測試紙卡的檢測件能評價
[0163] 1、靈敏度檢測
[0164] 1.1試劑和溶液：
[0165] a)萊克多巴胺儲備液（lmg/mL):準確稱取萊克多巴胺標準品50mg，用甲醇溶解后 稀釋至50mL，搖勻，-18°C以下冰箱中貯存備用，有效期90天。
[0166] b)萊克多巴胺工作液（lyg/mL):取萊克多巴胺儲備液0. lmL，加甲醇定容至 100mL，2°C~8°C冰箱中貯存備用，有效期7天。
[0167] c) 3ng/mL萊克多巴胺標準品：取萊克多巴胺工作液90 μ L，用尿液稀釋至30mL，混 勻。
[0168] d) 5ng/mL萊克多巴胺標準品：取萊克多巴胺工作液100 μ L，用尿液稀釋至20mL， 混勻。
[0169] e) 10ng/mL萊克多巴胺標準品：取萊克多巴胺工作液200 μ L，用尿液稀釋至20mL， 混勻。
[0170] 1.2檢測及結果
[0171] 取同一批號的本發明萊克檢測試紙卡9條，分別檢測三種濃度的Rac標準品（3ng/ mL，5ng/mL，10ng/mL)各3次，每種濃度的3次結果均為陽性才可判斷為此濃度的結果為陽 性。3ng/ml標準品檢測時，三次檢測結果中，兩次為陰性，一次為陽性；5ng/ml標準品檢測 時，三次檢測結果均為陽性。根據三種濃度的檢測結果進行判斷，本發明檢測試紙卡的靈敏 度為 3-5ppb。
[0172] 2、特異性
[0173] 2.1試劑和溶液：
[0174] a)鹽酸克侖特羅工作液100 μ g/mL，甲醇作為溶劑。
[0175] b) 500ng/mL鹽酸克侖特羅標準品：取鹽酸克侖特羅工作液100 μ L，用尿液稀釋至 20mL，混勻。
[0176] c)沙丁胺醇工作液100 μ g/mL，甲醇作為溶劑。
[0177] d) 500ng/mL沙丁胺醇標準品：取沙丁胺醇工作液100 μ L，用尿液稀釋至20mL，混 勻。
[0178] 2. 2檢測及結果
[0179] 分別對500ng/mL鹽酸克侖特羅、500ng/mL沙丁胺醇標準品進行檢測，各重復3次， 各溶液的3次結果均為陰性。檢測結果表明，本發明萊克多巴胺檢測試紙卡具有較好的特 異性。
【主權項】
1. 一種抗萊克多巴胺抗體，其特征在于，包括 重鏈可變區，其氨基酸序列含有以下的互補決定區：如序列SEQIDN0:2所示的HCDR1、如序列SEQIDNO:3所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO:4所示的HCDR3 ; 以及其輕鏈可變區，其氨基酸序列含有以下的互補決定區：如序列SEQIDNO:6所示 的LCDR1、如序列SEQIDNO:7所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO:8所示的LCDR3。2. 根據權利要求1所述的抗萊克多巴胺抗體，其特征在于，含有氨基酸序列如SEQID NO: 1所示的重鏈可變區和氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的輕鏈可變區。3. -種抗萊克多巴胺的單鏈抗體，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQIDNO: 11所示。4. 如權利要求3所述的單鏈抗體，其不含由六個組氨酸構成的HIS標簽。5. -種編碼如權利要求3所述抗體的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO: 12所 不。6. -種含有如權利要求5所述核苷酸序列的表達載體。7. -種含有如權利要求6所述表達載體的重組宿主細胞。8. 如權利要求7所述的重組宿主細胞為畢赤酵母。9. 一種生產如權利要求3所述單鏈抗體的方法，包括： 1) 在合適的條件下培養如權利要求7或8所述的重組宿主細胞表達抗體； 2) 然后從宿主細胞中純化、收集抗體。10. 權利要求1至4任一項所述的抗體在檢測萊克多巴胺殘留的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種萊克多巴胺抗體及其應用，屬于免疫學檢測領域。本發明通過萊克多巴胺抗原免疫動物及篩選得到雜交瘤細胞株，并進一步進行測序和重組表達得到所述高特異性抗體。本發明還提供了應用所述萊克多巴胺抗體的酶聯免疫試劑盒和膠體金試紙條，及其制備和檢測方法。本發明制備得到的萊克多巴胺抗體特異性高，成本低，以此制備得到的萊克多巴胺酶聯免疫試劑盒和膠體金試紙卡檢測萊克多巴胺具有操作方便、檢測成本低、特異性高、靈敏度高、準確度高等特點，可以定量或定性檢測動物尿液、血樣、組織及內臟等樣品中的萊克多巴胺殘留。
【IPC分類】G01N33/543, C07K16/44, C12R1/84, G01N33/558, C12N1/19, C12N15/13, C12N15/81
【公開號】CN105440137
【申請號】CN201510048100
【發明人】馬永, 趙利利, 楊蕓, 付紅, 王安良, 范宇, 徐春林, 陳一飛
【申請人】江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司, 常州京森生物醫藥研究所有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年1月29日