"（scFv)指的是抗體的重鏈可變區（VH)和輕鏈可變區（\)通過15~ 20個氨基酸短肽（linker)連接形成的單一鏈融合蛋白，用于連接的linker通常富含甘氨 酸和絲氨酸，以利于單鏈抗體的穩定性與柔韌性。連接方式可將\的N端連接至V "的C末 端，或者相反。盡管去除了恒定區并引入linker，單鏈抗體依然保留了抗體對抗原的特異 性，且其具有分子量小、穿透力強和抗原性弱等特點。
[0049] 互補決定區（complementarity-determining region, CDR)，也叫做高變區。成型 于抗體單體氨基酸的末端，是靶抗原與抗體結合的最關鍵區域，在免疫網絡理論中，每個抗 體的互補決定區又被稱為獨特型或者基因型。本申請中HCDR是指重鏈可變區中的互補決 定區，LCDR是指輕鏈可變區中的互補決定區。
[0050] 實施例1:抗萊克多巴胺雜奪瘤細朐株的制備
[0051] 1、動物免疫
[0052] 以萊克多巴胺偶聯牛血清白蛋白（Rac-BSA)偶聯物（免疫原）按照一般免疫程序 免疫BALB/c雌性小鼠（購自常州卡文斯實驗動物有限公司）。首先將弗氏完全佐劑/弗 氏不完全佐劑與Rac-BSA偶聯物等體積混合并反復吹打，使免疫原充分乳化，獲得濃度為 0. 5mg/mL的乳化免疫原。選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠采用皮下多點注射方 式接種上述乳化免疫原，每兩周免疫一次。具體免疫情況見下表：
[0053]
[0054] 從第二次免疫后開始，在免疫后一周時采用眼眶靜脈叢采血，用間接ELISA和競 爭ELISA法檢測免疫小鼠血清（萊克多巴胺偶聯卵清白蛋白偶聯物Rac-OVA檢測）的效價 和半數抑制價，選取血清效價和抑制價都最高的小鼠，進行免疫小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤 細胞進行融合。
[0055] 2、細胞融合
[0056] (1).脾臟細胞的制備
[0057] 取步驟1中血清效價和抑制價都最高的免疫小鼠，摘眼球取血，經斷頸椎處死后 置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分鐘后，于無菌操作臺中取其脾臟，置于細胞篩網中，充分 研磨細胞，過篩網，用無菌1640培養基（購自Gibco公司）離心洗滌數次后，重懸細胞以制 成單細胞懸液，并計數，備用。
[0058] (2).飼養細胞的制備
[0059] 取8~10周齡的雌性或雄性BALB/c小鼠一只，眼球取血制備陰性血清，經斷頸椎 處死后置于75% (v/v)酒精中浸泡10分鐘；無菌揭開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器將約 5mL 1640HT培養基（購自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，輕輕按摩腹部并吹打數次。吸取含 有巨噬細胞的培養基注入20% 1640HAT培養基中，備用；
[0060] 取2~3周齡的雌性或雄性BALB/c小鼠一只，經斷頸椎處死后置于75 % (v/v)酒 精中浸泡10分鐘；無菌取胸腺于細胞篩網中，研磨，過篩網，制成胸腺細胞懸液并注入上述 含有巨噬細胞的20% 1640HAT培養基中，備用。
[0061] (3).細胞融合
[0062] 選擇處于對數生長期的小鼠骨髓瘤株SP2/0,收集并計數，備用。
[0063] 取約10s個上述脾臟細胞與2X 10 7個上述SP2/0加入融合管中混合，lOOOrpm離 心10分鐘后棄上清（盡量棄凈），將融合管置手掌上來回輕輕摩擦以使沉淀松散。60秒內 先慢后快地加入lmL預熱的PEG1450 (聚乙二醇1450)(購自SIGMA公司），加入1640HT培 養基30mL終止，lOOOrpm離心10分鐘，去上清，輕輕摩擦使沉淀松散，加入步驟（2)所獲得 的20% 1640HAT培養基中。
[0064] 將上述20% 1640HAT培養基充分混勻后，200 μ L/孔分裝至96孔細胞培養板中， 置于37°C，5% C02細胞培養箱中培養。
[0065] -周后，10% 1640HT培養基替換20% 1640HAT培養基；換液10天后取上清進行 檢測。
[0066] 3、抗萊克多巴胺特異性淋巴細胞雜交瘤株篩選
[0067] (1).檢測板的準備
[0068] 用CB包被液稀釋萊克多巴胺偶聯卵清白蛋白偶聯物（Rac-〇VA)至2 μ g/mL，加入 至96孔酶標板中（100uL/孔），2~8°C包被過夜，洗滌拍干；2 %酪蛋白封閉，37°C封閉2小 時，PBST洗滌拍干，備用。
[0069] (2).陽性克隆的篩選
[0070] 將待檢細胞培養上清100 μ L/孔加入上述檢測板中，置于37°C條件下反應30分 鐘后洗滌并拍干；加入100 μ L/孔的HRP標記的抗體IgG，置于37°C條件下反應30分鐘后 洗滌并拍干；加入100 μ L/孔的TMB顯色液，于37°C避光顯色15分鐘后以50 μ L/孔的2M 氏304終止反應，并于0D450處讀取數值。陽性孔確定原則：0D450值/陰性對照值多2. 1。
[0071] 選取陽性克隆株進行競爭ELISA篩選，確定其抑制價：依次將50 μ L的Rac小分 子，50 μ L的HRP標記的羊抗鼠 IgG (購于博士德生物）以及50 μ L的陽性克隆株細胞培養 上清加入檢測板中，置于37°C條件下反應40分鐘后洗滌并拍干；加入100 μ L/孔的ΤΜΒ顯 色液，于37°C避光顯色15分鐘后以50 μ L/孔的2Μ H2S0$#止反應，并于0D450處讀取數 值并計算半數抑制濃度（IC50)。選取效價和半數抑制濃度最好的細胞株留種。
[0072] 其中雜交瘤細胞株上清檢測效價>105,半數抑制率為2. 5ng/mL，命名為抗萊克多 巴胺特異性雜交瘤細胞株C07,簡稱雜交瘤細胞株C07。
[0073] 實施例2:抗萊克多巴胺雜奪瘤細朐株抗體可奪岡序列的測宙
[0074] 對上述雜交瘤細胞株C07抗體可變區序列進行測定。
[0075] a. RNA的提取：參照細胞總RNA抽提試劑盒（購自Roche公司）說明書對上述雜 交瘤細胞株C07進行總RNA提取并立即進行反轉錄；
[0076] b. RNA 反轉錄成為 DNA :參照 Thermo Scientific Reverted First strand cDNA Synthesis Kit (購自Thermo公司）對上一步驟中所提取的總RNA進行反轉錄，制得cDNA， 凍存于_20°C備用；
[0077] c.可變區序列的PCR擴增及回收：以上一步驟中所得cDNA為模板，以鼠 IgG亞型 抗體可變區序列通用引物為引物，對重鏈及輕鏈的可變區序列進行PCR擴增，將PCR產物經 DNA膠回收試劑盒（購自TIANGEN公司）進行回收，見附圖1 ;
[0078] d.可變區序列的克隆和序列測定：按照克隆載體pMD18_T kit (購自Takara公 司）說明書，將重鏈和輕鏈可變區基因分別與PMD18-T載體進行連接，轉化大腸桿菌DH5a， 挑取陽性克隆，交由Invitrogen?公司進行測序。
[0079] 測序得到雜交瘤細胞株C07的抗體重鏈可變區基因序列如SEQ ID N0:9所示、輕 鏈可變區基因序列如SEQ ID N0:10所示。Vbase2數據庫分析上述序列，其重鏈可變區的 各互補決定區的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID N0:2所示的HCDR1、如序列SEQ ID N0: 3所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO :4所示的HCDR3 ;輕鏈可變區的各互補決定區的氨基 酸序列是：如序列SEQ ID N0 :6所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0 :7所示的LCDR2和如序列 SEQ ID N0 :8 所示的 LCDR3。
[0080] 實施例3.抗體的重組表汰及純化
[0081] 根據實施例2中測序結果，將雜交瘤細胞株C07的抗體重鏈及輕鏈可變區之間加 入連接肽（GGGGS) 3，引入六個組氨酸并將其全基因按照畢赤酵母表達系統的偏愛性進行密 碼子優化和抗體的重組表達，所表達得到的抗體命名為抗體K07,其結構組成如附圖2所 示。上述抗體的重組表達具有如下步驟：
[0082] a)融合蛋白基因的表達質粒構建
[0083] 密碼子優化后的抗體K07的基因序列如SEQ ID N0:12所示、氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。將優化后的抗體K07全基因合成的片段上游引入pPICZ α A載體中Xhol序列后 DNA序列，下游引入Xbal酶切位點，構建到pMD19_T Simple Vector質粒（購自Invitrogen 公司）中，得到一種長期保存質粒，質粒記為PMD19-K07。進行PCR擴增，所用引物序列如 下：
[0084] 上游引物：
[0085] PI:CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
[0086] 下游引物：
[0087] P2:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
[0088] 常規PCR程序后，瓊脂糖凝膠電泳分析（附圖3)，顯示產物大小與預期大小 (790bp) -致。將PCR獲得基因產物回收純化后，采用XhoI(#R0146S，購自New England Biolabs公司）和Xbal (#R0145V，購自New England Biolabs公司）雙酶切，用T4連接酶 連接到pPICZ aA(V19520,購自Invitrogen)質粒中，轉化到DH5a感受態細胞中，在含有 Zeocin(R250-01，購自Invitrogen公司）的LB平板中37°C培養過夜。第二天篩選陽性克 隆菌測序，比對，與預期序列完全一致，即得到抗體K07的表達質粒，記為pPICZ a -K07。
[0089] b)融合蛋白基因在畢赤酵母宿主工程菌株的構建、篩選及表達
[0090] 畢赤酵母感受態細胞及其相關的YPDS固體培養基、B