用于提取和儲存核酸的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于提取和儲存核酸的方法和組合物
[0001] 與相關申請的交叉引用 本申請為于2012年4月30日提交的標題為"用于提取和儲存核酸的方法和組合物"的 美國專利申請號13/460076和于2012年12月20日提交的標題為"用于在固體基質上穩定 核酸的配方"的美國專利申請號13/721948的部分繼續；所述兩個申請通過引用結合到本 文中。 發明領域
[0002] 本發明涉及用于以干燥形式從生物樣品環境提取和穩定核酸的固體基質和方法。 還描述了用于收集、提取、保存和從干燥固體基質回收核酸的方法。
[0003] 發明背景 從生物樣品分離或純化期間保持生物分子的結構和功能完整性對各種下游應用至關 重要。純化的生物分子的下游應用可包括分析物檢測、傳感、法醫、診斷或治療應用、測序、 擴增等。這些下游應用的成功可依賴于維持靶生物分子的完整結構和功能。多種因素，例 如溫度、壓力、pH、化學或酶水解或污染物的存在可引起生物分子例如DNA、RNA或蛋白質的 降解。
[0004] 由于化學自我水解和酶介導的降解，RNA為最不穩定的生物分子之一。衍生自生 物樣品的RNA的提取和穩定對許多環境因素敏感，包括，但不限于，用于提取或收集RNA的 緩沖劑、溶液pH、溫度，和特別地無處不在的強健的核糖核酸酶（RNA酶）。RNA通常以純化 和未純化的形式二者在冷凍下（例如4°C、_20°C或_80°C)儲存以防止水解和酶降解，并因 此保持RNA樣品的完整性。為了避免與用于維持RNA樣品完整性的冷凍相關的費用和空間 需求，用于在環境溫度下提取和穩定RNA的方法和物品是期需的。
[0005] 當前用于在環境溫度下穩定RNA的方法學集中于在過量，例如，去污劑、離液化合 物、還原劑、過渡金屬、有機溶劑、螯合劑、蛋白酶、RNA酶肽抑制劑和抗-RNA酶抗體的液體 溶液中滅活RNA酶。另外的嘗試集中于RNA的化學修飾以限制酯交換和自我水解。要求 以干燥形式成功收集和保存RNA的干燥-狀態技術通常需要RNA在RNA儲存前從樣品"預 先純化"和濃縮。其它用于以干燥形式保存RNA的干燥-狀態技術需要另外的干燥設施 (例如強制空氣流、凍干或熱處理）。因此這些方法在無顯著的樣品處理下不可執行（not conductive to)從樣品（例如，生物樣品）直接收集RNA。
[0006] 因此，需要使在單個處理步驟內于環境條件下從生物樣品的干燥-狀態RNA提取 和穩定成為可能的組合物和方法。此外，在環境溫度下將干燥的生物樣品儲存相當長一段 時間和其后回收完整的RNA用于進一步分析的能力是非常合乎需要的。
[0007] 發明概述 固體基質的一個實施方案包含至少一種蛋白變性劑和至少一種酸或酸-滴定的緩沖 試劑，其以干燥狀態漫布于其中；其中所述基質配置為當水化時提供酸性PH、從樣品提取 核酸和在環境溫度下以基本上干燥的狀態儲存核酸。
[0008] 在另一個實施方案中，RNA提取基質包含包括離液劑、去污劑或其組合在內的蛋白 變性劑；和酸或酸-滴定的緩沖試劑，其以干燥狀態漫布于其中，其中所述基質為多孔的不 可溶性干燥材料，其配制為當水化時提供2-7的pH，用于提取RNA和穩定所提取的RNA，所 述提取的RNA具有至少4的RNA完整性數值（RIN)。
[0009] 在一個實施方案中，RNA提取基質包含包括離液劑、去污劑或其組合在內的蛋白變 性劑；酸或酸-滴定的緩沖試劑；和包括三磷酸鹽或焦磷酸鹽在內的RNA酶抑制劑，其以干 燥狀態漫布于其中，其中所述基質包括多孔的不可溶性干燥材料，其配制為當水化時提供 2-7的pH，和穩定RNA，該RNA具有至少4的RNA完整性數值（RIN)。
[0010] 用于從樣品提取和儲存核酸的方法的一個實例包括以下步驟：向包含蛋白變性劑 和酸或酸滴定的緩沖試劑的干燥固體基質提供樣品；當水化時產生酸性pH用于從樣品提 取核酸；干燥包含所提取的核酸的基質；和在環境溫度下以基本上干燥的狀態在基質上儲 存提取的核酸。
[0011] 附圖 當參考附圖閱讀下列詳述時將更好地理解本發明的這些及其它特征、方面和優點，在 整個附圖中相似的字符代表相似的部分，其中： 圖1為P31 NMR譜，其顯示三（2-羧乙基）膦（TCEP)的氧化和TCEP氧化物（TCEP-0) 的制備。
[0012] 圖2顯示衍生自TCEP和TCEP-0對纖維素樣品的還原活性的5, 5' -二硫雙-(2-硝 基苯甲酸）（DTNB)比色測定法的條形圖。
[0013] 圖3顯示在包含TCEP或TCEP-0的化學處理的纖維素紙上收集的干燥血斑的RNA 完整性數值（RIN)。
[0014] 圖4顯示在多種化學處理的纖維素基質上收集并在Agilent 2100 Bioanalyzer 上分析RNA之前于環境溫度下儲存5、6或12天的干燥血斑的RNA完整性數值（RIN)。
[0015] 發明詳述 本發明的實施方案提供用于環境提取和保存核酸，例如RNA的合適的基質和方法。RNA 一般被認為是難以以完整形式保存的不穩定分子。本發明的一個或多個實施方案涉及一種 核酸提取基質，其中所述基質配置為在單個處理步驟內從生物樣品收集、提取和儲存核酸 達很長的時間，隨后在各種應用中使用。所述基質配置為在環境溫度下以基本上干燥的狀 態儲存核酸和基本上保留核酸的完整性。
[0016] 為了更清楚和簡明地描述所要求發明的主題，針對在下面的描述和所附權利要求 中使用的特殊術語提供下列定義。在整個說明書中，特殊術語的例示應被視為為非-限制 性的實例。
[0017] 單數形式"一個"、"一種"和"所述"包括復數提及物，除非上下文另外清楚指示。近 似的語言，如本文遍及說明書和權利要求所使用的，可應用于修飾任何數量表述，所述數量 表述可在不導致與其相關的基本功能的改變的情況下獲準變化。相應地，由術語例如"約" 所修飾的值不限于所指定的精確值。在一些情況下，近似的語言可相應于用于測量該值的 儀器的精密度。必要時，提供范圍，并且那些范圍包含其間的所有亞范圍。
[0018] 如本文所提及的術語"核酸"包括所有形式的RNA (例如，mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、 piRNA、ncRNA)、DNA (例如基因組DNA、mtDNA)，以及重組RNA和DNA分子或使用核苷酸類似 物產生的DNA或RNA的類似物。核酸可為單鏈的或雙鏈的。核酸可包含編碼或非編碼鏈。 該術語還包括核酸的片段，例如可使用所公開的提取方法回收的天然存在的RNA或DNA。 "片段"指核酸（例如，RNA或DNA)的一部分。
[0019] 如本文所提及的術語"生物樣品"包括，但不限于，從任何生物體，包括人，獲得的 血液、血清、組織和唾液。生物樣品可由經受自我-診斷測試（例如，血糖監測）的個體或 由受過培訓的醫學專業人員通過包括，例如，使用針吸血或刮或拭抹特定區域如患者皮膚 上的損傷在內的多種技術獲得。用于收集各種生物樣品的方法為本領域所熟知。術語"樣 品"包括如上所定義的生物樣品，但還包括，例如，組織培養的細胞和純化的核酸。
[0020] 如本文所提及的術語"還原劑"包括向另一種化學物類提供電子的任何化學物類。 本領域已知多種還原劑。示例性的還原劑包括二硫蘇糖醇（DTT)、2-巰基乙醇（2-ME)和三 (2-羧乙基）膦（TCEP)。此外，可使用這些或其它還原劑的任何組合。在具體的實施方案 中，還原劑為TCEP。
[0021] 如本文所使用的術語"緩沖劑"包括，例如2-氨基-2-羥甲基-丙烷-1，3-二醇 (Tris)、2-(A嗎啉代）乙磺酸（MES)、3-(A嗎啉代）丙磺酸（M0PS)、檸檬酸鹽緩沖劑、 4-(2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)，和磷酸鹽緩沖劑。該潛在的緩沖劑的列表僅用于 說明性目的。選擇用于本文所公開組合物和方法的緩沖劑的pH通常經酸滴定在2-7的范 圍內。
[0022] 固體基質的一個或多個實施方案包含至少一種蛋白變性劑和至少一種酸或 酸-滴定的緩沖試劑，其以干燥狀態漫布于其中，其中所述基質配置為當水化時提供酸性 pH。所述基質還配置為從樣品提取核酸和在環境溫度下以基本上干燥的狀態保存核酸。如 本文所使用的，術語"基本上干燥的狀態"指進一步干燥樣品至具有約小于2%的水含量。
[0023] 用于從樣品提取和儲存核酸的固體基質包含呈干燥狀態的至少一種酸或酸-滴 定的緩沖劑和蛋白變性劑。術語"基質"在本文中與"提取基質"可交換地使用。如本文所 使用的術語"固體基質"指不可溶的基質。所述基質使得能夠不溶解基質材料而收集、提取 和儲存核酸。所述固體基質包括，但不限于，諸如纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維