狀聚集，伸展度高，細胞明亮，匯合度達40-60% ;接種48小時后觀察細胞，hUC-MSC細胞明亮，達90%以上匯合，胰酶消化收集細胞凍存。
[0091]選擇地，細胞達100%匯合后，繼續培養后，細胞未卷起脫落，維持長時間良好貼壁。
[0092]細胞形態參見圖5。
[0093]將實施例6與實施例1相比較可知，本發明采取TME培養基和TMD培養基進行無血清分步培養，實現了與常規有血清培養的相同結果，但同時又避免了在培養細胞由于引入血清造成傳播異種病原體風險，也避免了培養過程中因血清批次差異導致細胞生長過程不穩定的情況。
[0094]實施例7流式細胞儀分析hUC-MSC的表面標志
[0095]取實施例6培養的第3代細胞，待細胞生長至90%匯合后，2mL 0.125%胰酶消化，然后在4°C下1200rpm離心6分鐘，棄上清收集細胞，PBS清洗兩次，將細胞每管1X105個轉移至流式管，分別加 5 μ L CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD90-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE、IgGl_PE(同型對照)和 IgGl_FITC(同型對照)抗體，混勻4°C下避光孵育30分鐘，PBS清洗一次，離心去上清，加500 μ L PBS緩沖液重懸混勻，上機檢測(流式細胞儀XL，Beckman公司)，每個樣本收集1 X 104個細胞。
[0096]結果參見圖6。
[0097]實施例8細胞活力儀分析hUC-MSC的細胞活力、生長特性
[0098]取實施例6培養的第3代細胞接種到T25培養瓶中，待細胞達到95% -100%匯合后，0.125%胰酶消化，收集細胞以1X105個/孔密度接種于兩個6孔板。待細胞全部貼壁且部分生長10小時后，收集兩孔細胞加500 μ L PBS制成細胞懸液，上機分析(細胞活力分析儀V1-Cell XR，Beckman公司)。此后每12小時取樣分析，繪制生長曲線。
[0099]結果參見圖7，表明hUC-MSC活性在99.7%以上，細胞直徑分布在在9_15 μ m，并且具有潛伏期、對數增長期、平臺期的增殖特性。
[0100]實施例9 hUC-MSC多向分化潛能的鑒定
[0101]1)成骨誘導分化
[0102]取實施例6培養的第3代hUC-MSC以3X 104個細胞/cm 2接種至6孔細胞培養板，24小時后，每孔添加新鮮配制的人UC MSC成骨誘導分化培養基(HUXUC-90021，賽業產品)2mL，此后每3天更換新鮮的成骨分化誘導培養基，2周后多聚甲醛固定，茜素紅染色3_5min0
[0103]結果參見圖8A，表明以本發明方法得到的hUC-MSC在成骨誘導兩周后，茜素紅與成骨過程的鈣結節發生深紅色顯色反應。
[0104]2)成脂誘導分化
[0105]取實施例6培養的第3代hUC-MSC以2 X 104個細胞/cm2接種至6孔細胞培養板，待細胞達到100%匯合后，每孔添加成脂誘導分化培養基A液(HUXUC-90031，賽業產品)開始誘導，3天后換成成脂誘導分化培養基B液進行維持24小時，如此循環。當脂滴出現較多但較小時，用成脂誘導液B維持7天，誘導結束后4%多聚甲醛固定，油紅0染色。
[0106]結果參見圖8B，表明以本發明方法得到的hUC-MSC在成脂誘導兩周后，油紅0對成脂細胞著色明顯。
[0107]實施例10免疫熒光染色分析hUC-MSC特異性蛋白
[0108]取實施例6培養的第5代hUC-MSC以5 X 103個細胞每孔的密度接種于24孔細胞培養板，待細胞生長至30%?50%匯合，以4%多聚甲醛固定15分鐘后用0.25%TritonX-100打孔處理20分鐘，山羊血清封閉后加稀釋好的鼠抗人一抗(抗-SOX2抗體、抗-0CT4抗體、抗-NANOG抗體和抗-NANOG抗體)，在4°C下過夜避光孵育；之后加FITC標記的山羊抗鼠二抗，在室溫下避光孵育2小時；然后以DAPI/PI染核，在室溫避光孵育20min，焚光顯微鏡下觀察。
[0109]結果參見圖9，表明以本發明方法分步培養的hUC-MSC表達S0X-2、OCT-4、NAN0G以及SSEA-4特異性蛋白。
[0110]以上對本發明【具體實施方式】的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。
【主權項】
1.一種用于hUC-MSC的無血清分步培養方法，其特征在于，所述方法包括:采用TME培養基和TMD培養基分步進行hUC-MSC的無血清培養，其中所述TME培養基含有a_MEM、β -巰基乙醇和非必需氨基酸，所述TMD培養基含有a-MEM/DMEM-F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)和血清替代物。2.根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述hUC-MSC為從自然分娩或剖宮產的健康新生兒臍帶組織分離出的人臍帶間充質干細胞。3.根據權利要求1或2所述的培養方法，其特征在于，所述TME培養基含有0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液和95-100體積份的a-MEM，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸； 優選地，所述TME培養基含有0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液和99體積份的a-MEM ; 優選地，所述TME培養基由所述a-MEM、β -巰基乙醇和非必需氨基酸水溶液組成。4.根據權利要求1至3中任一項所述的培養方法，其特征在于，所述TMD培養基包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、8-12體積份的血清替代物、85-95體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為5_15ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸； 優選地，所述TMD培養基包含0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、10體積份的血清替代物、89體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子； 優選地，所述TMD培養基由所述a-MEM/DMEM-F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重組人堿性成纖維生長因子和血清替代物組成。5.根據權利要求1至4中任一項所述的培養方法，其特征在于，所述培養方法包括以下步驟: (1)將hUC-MSC以0.5-4X 104個細胞/cm2的密度接種于TME培養基中進行貼壁培養； (2)培養3-6小時之后，棄去TME培養基，PBS清洗，更換為TMD培養基，每3_5天更換新鮮的TMD培養基； (3)待細胞達70-90%匯合后，收集細胞備用、凍存或重復步驟(1)和(2)傳代培養； 可選擇地，取步驟(3)收集的hUC-MSC細胞，檢測以下項目中的一項或多項:分化能力、細胞活性、細胞純度、細胞污染和增殖特性。6.根據權利要求1至5中任一項所述的培養方法，其特征在于，所述培養方法包括以下步驟: (1)將hUC-MSC以2X104個細胞/cm 2的密度接種于TME培養基中進行貼壁培養； (2)培養3-4小時后，棄去TME培養基，PBS清洗1次，更換為預先37°C孵育的TMD培養基，每3天更換新鮮的TMD培養基； (3)待細胞達90%匯合后，收集細胞備用、凍存或重復步驟(1)和(2)傳代培養； 可選擇地，取步驟(3)收集的hUC-MSC細胞，檢測以下項目中的全部:分化能力、細胞活性、細胞純度、細胞污染和增殖特性。7.通過權利要求1至6中任一項所述的方法獲得的hUC-MSC。8.根據權利要求7所述的hUC-MSC，其特征在于，所述hUC-MSC具有以下特征: (1)粘附于塑料培養器皿成梭形旋渦狀生長； (2)表達⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105和HLA-ABC的陽性比例大于99.0%;表達⑶45、⑶34和HLA-DR的陽性比例小于1.0% ; (3)體外可誘導分化為成骨細胞和成脂細胞； (4)活細胞檢測比率達99%以上； (5)呈典型的“S型”生長曲線特性； (6)多能性基因表達，所述多能性基因為選自SSEA-4、0CT-4、NAN0G和SOX-2中的一種或多種。9.一種用于無血清分步培養hUC-MSC的TME培養基和/或TMD培養基。10.根據權利要求9所述的TME培養基和/或TMD培養基，其特征在于，所述TME培養基包含a-MEM、β -巰基乙醇和非必需氨基酸，優選含有0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸和99體積份的a-MEM，更優選由所述a_MEM、β -巰基乙醇和非必需氨基酸組成； 所述TMD培養基含有a-MEM/DMEM-F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子和血清替代物，優選含有0.1體積份的β-巰基乙醇、10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子、1體積份的非必需氨基酸、10體積份的血清替代物和89體積份的a-MEM/DMEM-F12 ;更優選由所述a-MEM、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子和血清替代物組成。
【專利摘要】本發明公開了一種人臍帶間充質干細胞(human？umbilical？cord？mesenchymal？stem？cells，hUC-MSC)無血清培養方案。該方案采用分步法培養hUC-MSC：先使用TME培養基培養3-4小時促進hUC-MSC貼壁，然后更換為TMD培養基進行快速擴增。TME和TMD無血清分步培養法很好地解決了hUC-MSC無血清培養方法中細胞貼壁能力差、增殖緩慢、易分化等問題，為hUC-MSC進行長期穩定的無血清培養技術奠定基礎。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105420188
【申請號】CN201510920390
【發明人】郭鐳
【申請人】郭鐳, 里程, 圣釋（北京）生物工程有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月11日