一種hUC-MSC的無血清分步培養方法及采用所述方法獲得的hUC-MSC的制作方法
【專利說明】一種hUC-MSC的無血清分步培養方法及采用所述方法獲得的 hUC-MSC
技術領域
[0001]本發明涉及干細胞的研究領域，特別是涉及一種hUC-MSC的新型、高效的無血清培養方法。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞普遍存在于人體多種組織和器官中，并具有多向分化潛能，具有刺激組織再生、調節免疫等功能，在細胞治療領域有著廣闊的應用前景。
[0003]骨髓間充質干細胞已經在臨床上得到了廣泛應用，而目前的研究表明，臍帶來源的間充質干細胞不但能夠成為骨髓間充質干細胞的理想替代物，而且具有更大的應用潛能。其中，源于人臍帶的人臍帶間充質干細胞(human Umbilical Cord mesenchymal stemcells，hUC-MSC)表達多種胚胎干細胞的特有標志，具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業化制備等特征，而且研究證實hUC-MSC在神經疾病、免疫系統、內分泌系統以及癌癥、心臟病等疾病的動物模型和臨床研究中有良好治療效果，因此有可能成為最具臨床應用前景的多能干細胞。
[0004]若要將hUC-MSC進一步應用于臨床，最重要的就是hUC-MSC的體外大量擴增達到有效的臨床治療劑量，因此hUC-MSC的體外培養成為了最基礎同時也是最重要的技術之一。現有的hUC-MSC培養方法多采用在基礎培養基中添加FBS、青鏈霉素，但非人血清成分復雜，使hUC-MSC在長期的培養過程中易分化，且非存在傳播異種病原體的危險。
[0005]此外，雖然已有科研工作者開發出多種類型的血清替代物，但目前市場可購買的供hUC-MSC培養的血清替代物以及完全培養基的培養效果仍不理想，尤其對于干細胞的貼壁、增殖、以及細胞長期培養后的穩定性的維持等特性均無法達到預期效果。
【發明內容】
[0006]因此本發明的目的是針對本領域的需要，提供一種能夠獲得貼壁能力好、增殖快速、易分化的hUC-MSC培養方法。
[0007]本發明的另一目的是提供通過本發明的方法獲得的hUC-MSC。
[0008]具體而言，本發明提供一種新型的無血清分步培養hUC-MSC的培養方案，利用此方法可在無血清環境下進行hUC-MSC的長期擴增培養，同時確保其在長期培養情況下依然保持多潛能性及較強的增殖能力。
[0009]本發明的技術方案如下。
[0010]一方面，本發明提供了一種用于hUC-MSC的無血清分步培養方法，所述方法包括:采用TME培養基和TMD培養基分步進行hUC-MSC的無血清培養。
[0011]其中，所述hUC-MSC為從自然分娩或剖宮產的健康新生兒臍帶組織分離出的人臍帶間充質干細胞。目前本領域已有多種公知的人臍帶間充質干細胞分離方法。
[0012]本發明采用的TME培養基包含a-MEM、β -巰基乙醇和非必需氨基酸。優選地，所述TME培養基含有0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液和95-100體積份的a-MEM，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8_12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；更優選地，所述TME培養基含有0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液和99體積份的a-MEM ;進一步優選地，所述TME培養基由所述a-MEM、β -巰基乙醇和非必需氨基酸水溶液組成。
[0013]本發明采用的TMD培養基含有a-MEM/DMEM_F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)和血清替代物。
[0014]優選地，所述TMD培養基包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、8-12體積份的血清替代物、85-95體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；更優選地，所述TMD培養基包含0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、10體積份的血清替代物、89體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子。優選地，所述TMD培養基由所述a-MEM/DMEM-F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重組人堿性成纖維生長因子和血清替代物組成。
[0015]根據本申請的【具體實施方式】，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司貨號為11140的產品。
[0016]根據本申請的【具體實施方式】，所述血清替代物可以采用KnockOut?SerumReplacement (Gibco 公司產品，貨號 10828-010)。
[0017]進一步地，所述培養方法包括以下步驟:
[0018](1)將hUC-MSC以0.5-4X 104個細胞/cm2的密度接種于TME培養基中培養3-6小時；細胞在此步驟中進行顯著的貼壁；
[0019](2)棄去TME培養基，PBS清洗，更換為TMD培養基，每3_5天更換新鮮的TMD培養基；細胞在此步驟中進行顯著的擴增；
[0020](3)待細胞達70-90%匯合后，收集細胞備用、凍存或重復步驟(1)和(2)傳代培養;
[0021]可選擇地，取步驟(3)收集的hUC-MSC細胞，檢測以下項目中的一項或多項:分化能力、細胞活性、細胞純度、細胞污染和增殖特性。
[0022]優選地，所述培養方法包括以下步驟:
[0023](1)將hUC-MSC以2 X 104個細胞/cm2的密度接種于TME培養基中進行貼壁培養；
[0024](2)培養3-4小時后，棄去TME培養基，PBS清洗1次，更換為預先37°C孵育的TMD培養基，每3天更換新鮮的TMD培養基；
[0025](3)待細胞達90%匯合后，收集細胞備用、凍存或重復步驟(1)和(2)傳代培養；
[0026]可選擇地，取步驟(3)收集的hUC-MSC細胞，檢測以下項目中的全部:分化能力、細胞活性、細胞純度、細胞污染和增殖特性。
[0027]根據本發明的【具體實施方式】，所述用于hUC-MSC的無血清分步培養方法包括以下步驟:
[0028](1)使用TME培養基以一定密度接種hUC-MSC于六孔板或T75培養瓶內進行貼壁培養；優選地，hUC-MSC的接種密度為約2X 104個細胞/cm 2;
[0029](2)接種4小時后，用移液器小心吸棄舊TME培養基，用PBS洗一遍，更換為同樣預先37°C孵育的TMD培養基；
[0030](3)待細胞達90%匯合后，利用上述方案進行傳代培養或凍存細胞。
[0031]選擇性地，針對步驟(3)所得的hUC-MSC，檢測以下項目:分化能力、細胞活性、細胞純度、細胞污染和增殖特性。
[0032]另一方面，本發明還提供通過上述方法獲得的hUC-MSC。
[0033]優選地，所述hUC-MSC具有以下特征:
[0034](1)粘附于塑料培養器皿成梭形旋渦狀生長；
[0035](2)表達 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 和 HLA-ABC 的陽性比例大于 99.0% ;表達⑶45、CD34和HLA-DR的陽性比例小于1.0% ；
[0036](3)體外可誘導分化為成骨細胞和成脂細胞；
[0037](4)活細胞檢測比率達99 %以上；
[0038](5)呈典型的“S型”生長曲線特性；
[0039](6)多能性基因表達，所述多能性基因為選自SSEA-4、0CT_4、NAN0G和S0X-2中的一種或多種。
[0040]又一方面，本發明還提供在上述培養方法中采用的TME培養基和/或TMD培養基。
[0041]本發明中所述的TME培養基和TMD培養基均為無血清組分，且組成明晰，避免了在培養細胞培養過程中因血清批次差異導致細胞生長過程不穩定的情況，也排除了傳播異種病原體危險的可能。
[0042]此外，利用分步培養方案，先使用TME培養基培養促進hUC-MSC貼壁，然后更換為TMD培養基進行快速擴增，很好地解決了常規無血清培養中細胞貼壁能力差，增殖緩慢的缺點，且在長期培養過程中，細胞仍能保持良好的增殖能力和多向分化潛能，為動物細胞的體外培養提供了一種高效的解決方案。
[0043]并且，本發明的方法操作簡單易行，縮短了原代培養時間。
[0044]經流式細胞儀測定，經活力檢測、分化能力鑒定以及多能性基因分析，通過本發明方法獲得的間充質干細胞活率高，純度高，分化能力強，建立的細胞庫可直接用于科學研究和臨床輔助治療。
【附圖說明】
[0045]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
[0046]圖1是使用含血清培養基培養hUC-MSC的圖，其中圖1A為接種2小時后的細胞形態，圖1B為接種24小時后的細胞形態，圖1C為接種48小時后的細胞形態。
[0047]圖2是在培養基組成篩選過程中的細胞圖，其中圖2A為高濃度β-巰基乙醇培養基在細胞接種4小時后細胞形態，圖2Β為低濃度血清替代物培養基接種48小時后細胞形態，圖2C為高濃度血清替代物培養基接種24小時后細胞形態，圖2D為低濃度bFGF培養基接種24小時后細胞形態，圖2E為高濃度bFGF培養基培養細胞在傳代后細胞形態。
[0048]圖3是使用TME培養基培養hUC-MSC的圖，其中圖3A為接種2小時后的細胞形態，圖3B為接種24小時后的細胞形態，圖3C為接種48小時后的細胞形態。
[0049]圖4是使用TMD培養基培養hUC-MSC的圖，其中圖4A為接種2小時后的細胞形態，圖4B為接種24小時后的細胞形態，圖4C為接種48小時后的細胞形態。
[0050]圖5是利用本發明分步培養方法培養hUC-MSC的圖，其中圖5A為使用TME培養基接種2小時后的細胞形態，圖5B為使用TME培養基接種4小時