生產肉毒桿菌毒素的方法_3
全身循環減少。
[0048] 通過本發明方法生產的肉毒桿菌毒素被用作藥物組合物的有效成分。肉毒桿菌毒 素可用于治療表征為骨骼肌活動過度的神經肌肉病癥。此外，它可以用于各種癥狀，包括 頭痛、偏頭痛、緊張性頭痛、竇性頭痛、頸源性頭痛、出汗障礙、腋窩多汗癥、手掌多汗癥、跖 多汗癥、弗雷氏綜合征、運動過度皮膚線、面部皺紋、眉間皺紋、魚尾紋、木偶線、鼻唇溝、皮 膚病癥、食道失弛緩癥、斜視、慢性肛裂、眼瞼痙攣、肌肉骨骼疼痛、纖維肌痛、胰腺炎、心動 過速、前列腺肥大、前列腺炎、尿潴留、尿失禁、膀胱過動癥、肌痙攣、震顫、肌陣攣、胃腸功能 紊亂、糖尿病、流涎、逼尿肌-括約肌協同失調、中風后痙攣、傷口愈合、少年腦癱、平滑肌痙 攣、再狹窄、局部肌張力障礙、癲癇癥、頸部肌張力障礙、甲狀腺疾病、高鈣血癥、強迫癥、關 節痛、雷諾氏癥、萎縮紋、腹腔粘連、血管痙攣、流涕、肌肉攣縮、損傷的肌肉、喉肌張力障礙、 書寫痙攣和腕管綜合征。
[0049] 如本文所用的術語"藥物組合物"是指包含肉毒桿菌毒素作為有效成分的制劑， 并且該制劑除了肉毒桿菌毒素活性成分外，可以在藥物組合物中包含至少一種額外的成分 (賦形劑）。所述額外的成分可以選自白蛋白、人血清白蛋白、重組人血清白蛋白、明膠、蔗 糖、海藻糖、羥乙基淀粉、膠原蛋白、乳糖、蔗糖氯化鈉、多糖、辛酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮和鈉 組成的組，但并不限于此。另外，制備包含肉毒桿菌毒素作為有效成分的藥物組合物的方法 包括將肉毒桿菌毒素與額外的成分（賦形劑）結合的步驟，并且結合步驟可以選自由冷凍 干燥、凍干和真空干燥組成的工藝。
[0050] 因此，藥物組合物是適用于診斷、治療或美容施用（例如，通過肌內或皮下注射或 通過插入貯庫（depot)或植入物）受試者（如人類患者）的制劑。藥物組合物可以是：在凍 干或真空干燥的條件下，用鹽水或水對凍干或真空干燥的藥物組合物重構后形成的溶液； 或作為不需要重構的溶液。活性成分可以是肉毒桿菌毒素血清型A、B、Q、D、E、F或G或肉 毒桿菌毒素中的一種，所有這些都可以通過梭菌細菌本身制成。如上所述，藥物組合物可以 是液體或固體，例如真空干燥的。配制肉毒桿菌毒素活性成分的藥物組合物的示例性方法 公開于2002年11月5日公布的美國專利公開號2003-0118598。
[0051] 在本發明的另一實例中，為了確認由本發明方法生產的肉毒桿菌毒素蛋白質 (DWP450)的效果，測量復合肌肉動作電位（CMP)的幅度和傳導速度（tC)。在實驗中，將兩 種不同的A型肉毒桿菌毒素蛋白，BTX-A-I ( BOTOX?, Allergan Inc?，加利福尼亞州， 美國）和由本發明的實施例2中生產的BTX-A-2(DWP450)用于四個分組中。在組1中，將 0.08ml氯化鈉（NaCl)施用給一個TA肌肉，另一個肌肉不作處理。在第2組中，將0.02ml BTX-A-I (兩個單位）施用給一個TA肌肉而0· 02ml BTX-A-2 (兩個單位）施用給另一個TA 肌肉。在第3組中，將0.04ml BTX-A-I (4單位）施用給一個TA肌肉，而0.04ml BTX-A-2 (4 單位）施用給另一個TA肌肉。在組4中，將0.08ml BTX-A-I (8個單位）施用給一個TA肌 肉，而0. 08ml BTX-A-2 (8個單位）施用給另一個肌肉。
[0052] 肉毒桿菌毒素的一個單位被定義為經腹腔注射到每只重約18_20g的雌性Swiss Webster小鼠的LD5。。肉毒桿菌毒素的一個單位是殺死一組雌性Swiss Webster小鼠中的 50%的肉毒桿菌毒素的量。
[0053] 測量通過施用BTX-A-I和BTX-A-2而引起的復合肌肉動作電位（CMP)的幅度，結 果是，在2Hz的慢刺激速率，施用BTX-A-I和BTX-A-2的各組在施用后第3天、1周、2周、3 周和4周顯示出TA肌肉的麻痹作用（dY)(圖4A)，并且在20Hz的快刺激速率，施用BTX-A-I 和BTX-A-2的各組在施用后第3天、1周、2周、3周和4周顯示出TA肌肉的麻痹作用（dY) (圖4B)。在2Hz的慢刺激速率和20Hz的快刺激速率時，BTX-A-I和BTX-A-2之間沒有顯 著差異（P〈〇. 05)，并在施用BTX-A-I和BTX-A-2的各組中對TA肌肉的麻痹作用（dY)與肉 毒桿菌毒素的給藥劑量相關。
[0054] 測量施用BTX-A-I和BTX-A-2所造成的傳導速度（tC)，結果表明，在2Hz的慢刺激 速率和20Hz的快速刺激速率時，施用BTX-A-I和BTX-A-2的各組并沒有誘發傳導速度的延 遲（圖5)。
[0055] 具體地，由本發明方法生產的肉毒桿菌毒素表現出類似于市售BOTOX? (Allergan公司）的效果，并且因為它具有較高的純度，導致肉毒桿菌毒素在全身循環特性 的降低，因此安全提高了一倍。因此，可用于各種目的，包括治療神經肌肉障礙，去除皺紋， 和治療痙攣性偏癱和腦癱。
[0056] 以下，參照實施例對本發明進行更詳細的說明。本領域的普通技術人員顯而易見 的是，這些實施例是說明性的目的，并且不應被解釋為限制或改變本發明的范圍。
[0057] 實施例1 :肉毒桿菌菌株的培養
[0058] 1-1 :用于培養物的培養基組成
[0059] 使用具有包含2%酪蛋白水解物，1%酵母提取物，1%葡萄糖和0. 5%巰基乙酸的 組合物的培養基用于肉毒梭菌菌株的種子培養和主培養，以生產肉毒桿菌毒素。
[0060] 1-2 :肉毒梭菌菌株的種子培養
[0061] 將20 μ 1肉毒梭菌（韓國疾病控制和預防中心，保藏號：4-029-CBB-IS-001)接種 到含有IOml具有實施例1-1中所述組成的無菌培養基的培養管中并在35°C厭氧條件下進 行初級種子培養（靜止培養）22-30小時。當確認了在初級種子培養中的菌株生長時，將 8ml初級種子培養物接種到含有800ml的具有相同培養基組成的無菌培養基的11培養瓶中 并在35°C厭氧條件下進行二次種子培養（靜止培養）8-15小時。
[0062] 1-3 :肉毒梭菌菌株的主培養
[0063] 為了通過培養肉毒梭菌菌株生產肉毒桿菌毒素，進行菌株的主培養。具體而言，制 備9. 31具有實施例1-1中所述組成的培養基并放置在101培養箱中，接著對培養基滅菌。 供給氮氣以制造厭氧條件，并在35°C的溫度下以50rpm的攪拌速度進行菌株生長。
[0064] 在11培養瓶中進行了實施例1-2的二次種子培養的菌株通過連接到101培養箱 的接種端口的接種線而接種到101培養箱。在35°c和50rpm的條件下培養101培養箱中 的肉毒梭菌菌株并維持、檢查和記錄設定的培養條件。當菌株培養100小時以上，完成主培 養。
[0065] 實施例2 :肉毒桿菌毒素的生產
[0066] 2-1 :用硫酸沉淀的步驟
[0067] 用硫酸沉淀的步驟是一種蛋白分離方法，其中將硫酸添加到含有許多種蛋白質的 培養物中以降低培養物的PH，同時殺死培養之后剩余的肉毒桿菌以使蛋白質達到等電點而 沉淀。按實施例1-3中描述進行主培養并且在主培養結束后，通過自動栗將5N硫酸加入到 培養物中，以使101培養箱的pH傳感器測得的pH達到3. 4-3. 6,然后將培養物通過培養箱 的收集線轉移至201容器（AS 0ΝΕ，目錄號AS5. 372. 06)，并將含有硫酸沉淀物的201容器 轉移至生物安全柜（BSC)。然后，在BSC中用硫酸進行沉淀。
[0068] 2-2 :酶處理和毒素提取
[0069] 從硫酸沉淀物除去上清液后，將700ml IM磷酸鈉緩沖液（pH 5.3)加入到沉淀物 中。然后，加入5N氫氧化鈉（NaOH)將溶液調節到pH為5. 0-6.0。為從沉淀物除去DNA和 RNA，加入60ml的0. 4M苯甲脒鹽酸，Ig DNase和Ig RNase并與溶液反應約5小時，以提取 肉毒桿菌毒素。
[0070] 2-3 :鹽酸沉淀和毒素溶解
[0071] 將包括毒素提取物的培養物在4°C以12000 Xg離心15分鐘以將其分離成沉淀和 上清液，將分離的上清液轉移至新的101瓶（AS 0ΝΕ，目錄號AS5. 372. 04)，然后通過加入 IN鹽酸（HCl)調整pH為3. 4-3. 6,并在4°C在冰箱中進行鹽酸沉淀。將鹽酸沉淀物在4°C 以12000Xg離心15分鐘，除去上清液，在這之后向毒素沉淀中加入50ml磷酸鈉緩沖液（pH 6. 5)以溶解毒素。
[0072] 2-4 :初級陰離子交換色譜
[0073] 沉淀過程完成后，為了除去A型肉毒桿菌毒素以外的大多數主要的雜質，使用 離子交換樹脂進行色譜。具體地，將陰離子交換樹脂（Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience，P/N 17228)填充到柱中，然后將在實施例2-3沉淀的樣品注入到柱中，用50mM 磷酸鈉洗脫緩沖液洗脫該毒素。在初級純化步驟中，A型肉毒桿菌毒素蛋白質并未吸附在 陰離子交換樹脂，而大多數主要的雜質通過吸附被除去。為了高純度肉毒桿菌毒素的純化， 將樣品保持在pH為4. 5-7. 0和電導率為5-20mS/cm。
[0074] 2-5 :硫酸銨沉淀
[0075] 收集通過陰離子交換色譜法純化的含有A型肉毒桿菌毒素蛋白的級分，并向其中 加入濃度為20-40% (w/v)的硫酸銨，以再次沉淀該A型肉毒桿菌毒素蛋白。沉淀出的A型 肉毒桿菌毒素蛋白在50mM磷酸鈉（pH6.5)中再次溶解。
[0076] 2-6 :二次離子交換色譜
[0077] 硫酸銨沉淀過程完成后，為了除去A型肉毒桿菌毒素以外的微量雜質，采用離 子交換樹脂再次進行色譜。具體地，將陰離子交換樹脂（Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience，P/N 17228)填充到柱中，在此之后，將在實施例2-5中溶解的硫酸銨沉淀物注 入柱中，用50mM磷酸鈉洗脫緩沖液洗脫毒素。此時，A型肉毒桿菌毒素蛋白質未被吸附，而 少量雜質通過吸附被除去。
[0078] 高純度肉毒桿菌毒素的純化主要是在初級陰離子交換色譜步驟中實現，進行通過 二次陰離子交換色譜的純化步驟，以除去殘留的雜質。為了高純度肉毒桿菌毒素的純化，維 持硫酸銨沉淀物的pH為4. 5-7. 0和電導率為5-20mS/cm。
[0079] 2-7 :粗液制備
[0080] 收集在實施例2-6中通過陰離子交換色
[0048] 通過本發明方法生產的肉毒桿菌毒素被用作藥物組合物的有效成分。肉毒桿菌毒 素可用于治療表征為骨骼肌活動過度的神經肌肉病癥。此外，它可以用于各種癥狀，包括 頭痛、偏頭痛、緊張性頭痛、竇性頭痛、頸源性頭痛、出汗障礙、腋窩多汗癥、手掌多汗癥、跖 多汗癥、弗雷氏綜合征、運動過度皮膚線、面部皺紋、眉間皺紋、魚尾紋、木偶線、鼻唇溝、皮 膚病癥、食道失弛緩癥、斜視、慢性肛裂、眼瞼痙攣、肌肉骨骼疼痛、纖維肌痛、胰腺炎、心動 過速、前列腺肥大、前列腺炎、尿潴留、尿失禁、膀胱過動癥、肌痙攣、震顫、肌陣攣、胃腸功能 紊亂、糖尿病、流涎、逼尿肌-括約肌協同失調、中風后痙攣、傷口愈合、少年腦癱、平滑肌痙 攣、再狹窄、局部肌張力障礙、癲癇癥、頸部肌張力障礙、甲狀腺疾病、高鈣血癥、強迫癥、關 節痛、雷諾氏癥、萎縮紋、腹腔粘連、血管痙攣、流涕、肌肉攣縮、損傷的肌肉、喉肌張力障礙、 書寫痙攣和腕管綜合征。
[0049] 如本文所用的術語"藥物組合物"是指包含肉毒桿菌毒素作為有效成分的制劑， 并且該制劑除了肉毒桿菌毒素活性成分外，可以在藥物組合物中包含至少一種額外的成分 (賦形劑）。所述額外的成分可以選自白蛋白、人血清白蛋白、重組人血清白蛋白、明膠、蔗 糖、海藻糖、羥乙基淀粉、膠原蛋白、乳糖、蔗糖氯化鈉、多糖、辛酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮和鈉 組成的組，但并不限于此。另外，制備包含肉毒桿菌毒素作為有效成分的藥物組合物的方法 包括將肉毒桿菌毒素與額外的成分（賦形劑）結合的步驟，并且結合步驟可以選自由冷凍 干燥、凍干和真空干燥組成的工藝。
[0050] 因此，藥物組合物是適用于診斷、治療或美容施用（例如，通過肌內或皮下注射或 通過插入貯庫（depot)或植入物）受試者（如人類患者）的制劑。藥物組合物可以是：在凍 干或真空干燥的條件下，用鹽水或水對凍干或真空干燥的藥物組合物重構后形成的溶液； 或作為不需要重構的溶液。活性成分可以是肉毒桿菌毒素血清型A、B、Q、D、E、F或G或肉 毒桿菌毒素中的一種，所有這些都可以通過梭菌細菌本身制成。如上所述，藥物組合物可以 是液體或固體，例如真空干燥的。配制肉毒桿菌毒素活性成分的藥物組合物的示例性方法 公開于2002年11月5日公布的美國專利公開號2003-0118598。
[0051] 在本發明的另一實例中，為了確認由本發明方法生產的肉毒桿菌毒素蛋白質 (DWP450)的效果，測量復合肌肉動作電位（CMP)的幅度和傳導速度（tC)。在實驗中，將兩 種不同的A型肉毒桿菌毒素蛋白，BTX-A-I ( BOTOX?, Allergan Inc?，加利福尼亞州， 美國）和由本發明的實施例2中生產的BTX-A-2(DWP450)用于四個分組中。在組1中，將 0.08ml氯化鈉（NaCl)施用給一個TA肌肉，另一個肌肉不作處理。在第2組中，將0.02ml BTX-A-I (兩個單位）施用給一個TA肌肉而0· 02ml BTX-A-2 (兩個單位）施用給另一個TA 肌肉。在第3組中，將0.04ml BTX-A-I (4單位）施用給一個TA肌肉，而0.04ml BTX-A-2 (4 單位）施用給另一個TA肌肉。在組4中，將0.08ml BTX-A-I (8個單位）施用給一個TA肌 肉，而0. 08ml BTX-A-2 (8個單位）施用給另一個肌肉。
[0052] 肉毒桿菌毒素的一個單位被定義為經腹腔注射到每只重約18_20g的雌性Swiss Webster小鼠的LD5。。肉毒桿菌毒素的一個單位是殺死一組雌性Swiss Webster小鼠中的 50%的肉毒桿菌毒素的量。
[0053] 測量通過施用BTX-A-I和BTX-A-2而引起的復合肌肉動作電位（CMP)的幅度，結 果是，在2Hz的慢刺激速率，施用BTX-A-I和BTX-A-2的各組在施用后第3天、1周、2周、3 周和4周顯示出TA肌肉的麻痹作用（dY)(圖4A)，并且在20Hz的快刺激速率，施用BTX-A-I 和BTX-A-2的各組在施用后第3天、1周、2周、3周和4周顯示出TA肌肉的麻痹作用（dY) (圖4B)。在2Hz的慢刺激速率和20Hz的快刺激速率時，BTX-A-I和BTX-A-2之間沒有顯 著差異（P〈〇. 05)，并在施用BTX-A-I和BTX-A-2的各組中對TA肌肉的麻痹作用（dY)與肉 毒桿菌毒素的給藥劑量相關。
[0054] 測量施用BTX-A-I和BTX-A-2所造成的傳導速度（tC)，結果表明，在2Hz的慢刺激 速率和20Hz的快速刺激速率時，施用BTX-A-I和BTX-A-2的各組并沒有誘發傳導速度的延 遲（圖5)。
[0055] 具體地，由本發明方法生產的肉毒桿菌毒素表現出類似于市售BOTOX? (Allergan公司）的效果，并且因為它具有較高的純度，導致肉毒桿菌毒素在全身循環特性 的降低，因此安全提高了一倍。因此，可用于各種目的，包括治療神經肌肉障礙，去除皺紋， 和治療痙攣性偏癱和腦癱。
[0056] 以下，參照實施例對本發明進行更詳細的說明。本領域的普通技術人員顯而易見 的是，這些實施例是說明性的目的，并且不應被解釋為限制或改變本發明的范圍。
[0057] 實施例1 :肉毒桿菌菌株的培養
[0058] 1-1 :用于培養物的培養基組成
[0059] 使用具有包含2%酪蛋白水解物，1%酵母提取物，1%葡萄糖和0. 5%巰基乙酸的 組合物的培養基用于肉毒梭菌菌株的種子培養和主培養，以生產肉毒桿菌毒素。
[0060] 1-2 :肉毒梭菌菌株的種子培養
[0061] 將20 μ 1肉毒梭菌（韓國疾病控制和預防中心，保藏號：4-029-CBB-IS-001)接種 到含有IOml具有實施例1-1中所述組成的無菌培養基的培養管中并在35°C厭氧條件下進 行初級種子培養（靜止培養）22-30小時。當確認了在初級種子培養中的菌株生長時，將 8ml初級種子培養物接種到含有800ml的具有相同培養基組成的無菌培養基的11培養瓶中 并在35°C厭氧條件下進行二次種子培養（靜止培養）8-15小時。
[0062] 1-3 :肉毒梭菌菌株的主培養
[0063] 為了通過培養肉毒梭菌菌株生產肉毒桿菌毒素，進行菌株的主培養。具體而言，制 備9. 31具有實施例1-1中所述組成的培養基并放置在101培養箱中，接著對培養基滅菌。 供給氮氣以制造厭氧條件，并在35°C的溫度下以50rpm的攪拌速度進行菌株生長。
[0064] 在11培養瓶中進行了實施例1-2的二次種子培養的菌株通過連接到101培養箱 的接種端口的接種線而接種到101培養箱。在35°c和50rpm的條件下培養101培養箱中 的肉毒梭菌菌株并維持、檢查和記錄設定的培養條件。當菌株培養100小時以上，完成主培 養。
[0065] 實施例2 :肉毒桿菌毒素的生產
[0066] 2-1 :用硫酸沉淀的步驟
[0067] 用硫酸沉淀的步驟是一種蛋白分離方法，其中將硫酸添加到含有許多種蛋白質的 培養物中以降低培養物的PH，同時殺死培養之后剩余的肉毒桿菌以使蛋白質達到等電點而 沉淀。按實施例1-3中描述進行主培養并且在主培養結束后，通過自動栗將5N硫酸加入到 培養物中，以使101培養箱的pH傳感器測得的pH達到3. 4-3. 6,然后將培養物通過培養箱 的收集線轉移至201容器（AS 0ΝΕ，目錄號AS5. 372. 06)，并將含有硫酸沉淀物的201容器 轉移至生物安全柜（BSC)。然后，在BSC中用硫酸進行沉淀。
[0068] 2-2 :酶處理和毒素提取
[0069] 從硫酸沉淀物除去上清液后，將700ml IM磷酸鈉緩沖液（pH 5.3)加入到沉淀物 中。然后，加入5N氫氧化鈉（NaOH)將溶液調節到pH為5. 0-6.0。為從沉淀物除去DNA和 RNA，加入60ml的0. 4M苯甲脒鹽酸，Ig DNase和Ig RNase并與溶液反應約5小時，以提取 肉毒桿菌毒素。
[0070] 2-3 :鹽酸沉淀和毒素溶解
[0071] 將包括毒素提取物的培養物在4°C以12000 Xg離心15分鐘以將其分離成沉淀和 上清液，將分離的上清液轉移至新的101瓶（AS 0ΝΕ，目錄號AS5. 372. 04)，然后通過加入 IN鹽酸（HCl)調整pH為3. 4-3. 6,并在4°C在冰箱中進行鹽酸沉淀。將鹽酸沉淀物在4°C 以12000Xg離心15分鐘，除去上清液，在這之后向毒素沉淀中加入50ml磷酸鈉緩沖液（pH 6. 5)以溶解毒素。
[0072] 2-4 :初級陰離子交換色譜
[0073] 沉淀過程完成后，為了除去A型肉毒桿菌毒素以外的大多數主要的雜質，使用 離子交換樹脂進行色譜。具體地，將陰離子交換樹脂（Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience，P/N 17228)填充到柱中，然后將在實施例2-3沉淀的樣品注入到柱中，用50mM 磷酸鈉洗脫緩沖液洗脫該毒素。在初級純化步驟中，A型肉毒桿菌毒素蛋白質并未吸附在 陰離子交換樹脂，而大多數主要的雜質通過吸附被除去。為了高純度肉毒桿菌毒素的純化， 將樣品保持在pH為4. 5-7. 0和電導率為5-20mS/cm。
[0074] 2-5 :硫酸銨沉淀
[0075] 收集通過陰離子交換色譜法純化的含有A型肉毒桿菌毒素蛋白的級分，并向其中 加入濃度為20-40% (w/v)的硫酸銨，以再次沉淀該A型肉毒桿菌毒素蛋白。沉淀出的A型 肉毒桿菌毒素蛋白在50mM磷酸鈉（pH6.5)中再次溶解。
[0076] 2-6 :二次離子交換色譜
[0077] 硫酸銨沉淀過程完成后，為了除去A型肉毒桿菌毒素以外的微量雜質，采用離 子交換樹脂再次進行色譜。具體地，將陰離子交換樹脂（Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience，P/N 17228)填充到柱中，在此之后，將在實施例2-5中溶解的硫酸銨沉淀物注 入柱中，用50mM磷酸鈉洗脫緩沖液洗脫毒素。此時，A型肉毒桿菌毒素蛋白質未被吸附，而 少量雜質通過吸附被除去。
[0078] 高純度肉毒桿菌毒素的純化主要是在初級陰離子交換色譜步驟中實現，進行通過 二次陰離子交換色譜的純化步驟，以除去殘留的雜質。為了高純度肉毒桿菌毒素的純化，維 持硫酸銨沉淀物的pH為4. 5-7. 0和電導率為5-20mS/cm。
[0079] 2-7 :粗液制備
[0080] 收集在實施例2-6中通過陰離子交換色
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0訪客 來自[中國] 2023年10月28日 20:52你好！你可以提取肉毒素菌種嗎？可以的話請加MB0301，可以合作科研
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