生產肉毒桿菌毒素的方法
生產肉毒桿菌毒素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生產肉毒桿菌毒素的方法，更具體地涉及一種用于制備肉毒桿菌毒素 的方法，該方法包括步驟：(a)用酸處理肉毒桿菌毒素生產株的培養物，以沉淀肉毒桿菌毒 素；(b)向沉淀的肉毒桿菌毒素中加入緩沖液，接著用蛋白酶抑制劑和核酸酶處理，從而提 取肉毒桿菌毒素；（C)用酸處理提取出的肉毒桿菌毒素以沉淀肉毒桿菌毒素并在緩沖液中 溶解沉淀物；和（d)通過陰離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素。
【背景技術】
[0002] 自19世紀90年代已發現各種分泌神經毒素的梭菌屬（Clostridium sp.) 的菌株，并且在過去的70年已對從這些菌株分泌的毒素進行了表征（Schant，E. J.et al.，Microbiol. Rev.，56:80, 1992)。
[0003] 源自梭菌屬菌株的神經毒素，即肉毒桿菌毒素，根據它們的血清學性質被分為 七種類型（類型A至G)。每種毒素具有約150KDa大小的毒素蛋白并且天然含有幾種 非毒性蛋白的復合物。中等復合物（300kDa)由毒素蛋白和無毒的非血凝素蛋白組成， 大復合物（450kDa)和非常大的復合物（900kDa)由結合到血凝素的中等復合物組成 (Sugiyama, H.，Microbiol. Rev.，44:419, 1980)。已知這種非毒性的血凝素蛋白是用于保護 毒素免受腸道內的低PH值和各種蛋白酶的作用。
[0004] 在細胞中，毒素被合成為具有約150kDa的分子量的單個多肽，然后通過胞內蛋白 酶作用或用人造酶如胰蛋白酶處理，在從N-末端開始的1/3位置裂解成兩個單位：輕鏈 (L ;分子量：50kDa)和重鏈（H ;分子量：100kDa)。相比于單個多肽，裂解的毒素具有大大 增加的毒性。兩個單位通過二硫鍵彼此連接并具有不同的功能。重鏈結合至靶細胞的受體 (Park. Μ. K.，et al·，FEMS Microbiol. Lett. ,72:243,1990)并用于在低 pH 值（pH 4)與生 物膜相互作用，以形成通道（Mantecucco, C. et al.，TIBS.，18:324, 1993)，輕鏈具有藥理活 性，因此通過例如電穿孔導入細胞時，利用洗滌劑賦予細胞滲透性或干擾神經遞質的分泌 (Poulain, B. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 85:4090, 1988) 〇
[0005] 毒素在神經肌肉接頭的膽堿能神經突觸前處抑制乙酰膽堿的胞吐作用，造成乏 力。已認為用非常少量的毒素進行處理展現毒性，這表明毒素具有任何酶活性（Simpson，L. L. et al.，Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol.，26:427, 1986) 〇
[0006] 根據最近的報道，毒素具有金屬肽酶活性，并且其底物由小突觸、突觸融合蛋白、 25KDa的突觸相關蛋白（SNAP25)等組成，它們是胞吐機械復合物的單位蛋白。每種類型的 毒素使用上述三種蛋白質之一作為底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位點裂解小突 觸，A型和E型毒素在特定位點裂解SNAP25,和C型在特定位點裂解突觸融合蛋白（Binz，T. et al.，J. Biol. Chem.，265:9153, 1994) 〇
[0007] 特別是，已知A型肉毒桿菌毒素可溶于pH為4. 0-6. 8的稀釋水溶液。已知穩定的 非毒性蛋白質在PH大約為7或更高時從神經毒素中分離，并且結果是，毒性逐漸喪失。特 別是，已知毒性隨pH和溫度的增加而減少。
[0008] 肉毒桿菌毒素即使少量對人體也是致命的并且易于大量產生。因此，它與炭疽桿 菌、鼠疫和天花病毒一起構成四大生物恐怖武器。然而發現，當A型肉毒桿菌毒素在以不全 身影響人體的劑量注射時，它可以在注射部位使局部肌肉麻痹。根據這個特點，A型肉毒桿 菌毒素可以在廣泛的應用中使用，包括除皺紋藥劑，治療痙攣性偏癱和腦癱的藥劑等。因此 對于A型肉毒桿菌毒素的需求增加，并且已積極地進行對生產肉毒桿菌毒素以滿足該需求 的方法的研究。
[0009] 目前典型的商品化產品是購自美國Allergan公司的BOTOX? (純化的A型肉 毒桿菌毒素的神經毒素復合物）。100單位小瓶的BOTOX?由約5ng的純化的A型肉毒桿 菌毒素的神經毒素復合物，〇. 5mg人血清白蛋白和0. 9mg氯化鈉組成并且用不含防腐劑的 無菌鹽水（注射0.9 %氯化鈉）重構。其他商品化產品包括購自Ipsen Ltd.，UK, MyoBloc? 的:Dysport⑩（A型肉毒桿菌毒素和血凝素的復合物，其在含有肉毒桿菌毒素的藥物組 合物中具有乳糖和人血清白蛋白并在使用前用〇. 9%氯化鈉重構），（可注射溶液（pH 約5. 6)，包含B型肉毒桿菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸鈉和氯化鈉），購自Solstice Neurosciences，Inc.。常規用于生產肉毒桿菌毒素的方法包括酸沉淀法、鹽沉淀法和色譜 法。
[0010] 例如，日本專利公開號1994-192296公開了一種通過培養肉毒梭菌細菌，接著進 行酸沉淀，提取，添加核酸酶和結晶來生產結晶A型肉毒桿菌毒素的方法。此外，美國專利 5696077公開了一種通過培養肉毒梭菌細菌，接著進行酸沉淀，提取，離子交換色譜，凝膠過 濾色譜和結晶來生產結晶B型肉毒桿菌毒素的方法。
[0011] Simpson等人通過重力流色譜，隨后通過HPLC，使用親和樹脂、大小排阻色譜，和 包括使用兩種不同的離子交換柱的離子（陰離子和陽離子）交換色譜的捕獲來純化肉毒神 經毒素，生產A型肉毒桿菌毒素 （Method in Enzymology, 165:76, 1988)，王等人使用沉淀和 離子色譜來純化A型肉毒桿菌毒素 （Dermatol Las Faci Cosm Surg. ,2002:58, 2002)。
[0012] 此外，美國專利6818409公開了使用離子交換和乳糖柱純化肉毒桿菌毒素，和美 國專利號7452697公開了一種通過離子交換色譜和疏水色譜的A型肉毒桿菌毒素。韓國專 利公開號2009-0091501公開了通過酸沉淀和陰離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素的方法， 以及美國公開號2013-0156756公開了通過陰離子交換色譜和陽離子交換色譜純化肉毒桿 菌毒素的方法。
[0013] 然而，傳統方法的問題在于使用陰離子交換色譜不利地影響肉毒桿菌毒素的凝膠 條帶圖案（美國專利號7452697)，并且問題還在于這些常規方法由于純化時間長而難以商 業上應用。另外，由于作為肉毒桿菌毒素生產菌株的肉毒桿菌是一種厭氧細菌，存在著細菌 發酵應在厭氧系統中執行的問題，因此難以大量生產肉毒桿菌毒素。此外，存在著通過上述 純化方法純化的活性成分肉毒桿菌毒素并未清楚地分離和鑒定的問題，并因此含有雜質。 此外，生產肉毒桿菌毒素的傳統方法存在著必需要進行過濾或透析過程以純化高純度的肉 毒桿菌毒素的問題，這表明純化過程是復雜且困難的。
[0014] 因此，本發明人進行了廣泛的努力，以解決現有技術中存在的上述問題，并且結果 發現，當肉毒桿菌毒素生產株的培養物用酸處理以形成肉毒桿菌毒素沉淀物并且通過陰離 子交換色譜純化所形成的沉淀物時，可以省略過濾、透析和乙醇沉淀步驟，并且生產所述肉 毒桿菌毒素的工藝非常容易，并且通過該生產方法可以生產具有98%或更高純度的肉毒桿 菌毒素，從而完成了本發明。
【發明內容】
[0015] 本發明的一個目的是提供一種通過簡單的工藝來生產高純度肉毒桿菌毒素的方 法。
[0016] 為了達到上述目的，本發明提供了用于生產肉毒桿菌毒素的方法，該方法包括以 下步驟：(a)用酸處理肉毒桿菌毒素生產株的培養物，以沉淀肉毒桿菌毒素；(b)向沉淀的 肉毒桿菌毒素中加入緩沖液，接著用蛋白酶抑制劑和核酸酶處理，從而提取肉毒桿菌毒素； (c) 用酸處理提取出的肉毒桿菌毒素以沉淀肉毒桿菌毒素并在緩沖液中溶解沉淀物；和 (d) 通過陰離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素。
【附圖說明】
[0017] 圖1是示出根據本發明的生產肉毒桿菌毒素的過程的示意圖。
[0018] 圖2示出測量通過初級陰離子交換色譜對肉毒桿菌毒素進行純化后的純度結果。
[0019] 圖3示出測量通過二次陰離子交換色譜對肉毒桿菌毒素進行純化后的純度結果。
[0020] 圖4示出測量用本發明方法生產的肉毒桿菌毒素和BOTOX? (Allergan)處 理所造成的復合肌肉動作電位振幅的增加或減少的結果。N :無注射液；S :鹽水注射；B2 : BTX-A-I，兩個單位；D2 :BTX-A-2,兩個單位；B4 :BTX-A-1，四個單位；D4 :BTX-A-2,四個單 位；B8 :BTX-A-1，八個單位；和D8 :BTX-A-2,八個單位。
[0021] 圖5示出測量用本發明方法生產的肉毒桿菌毒素和BOTOSi (Allergan)處 理所造成的傳導速度的結果。N :無注射液；S :鹽水注射；B2 :BTX-A-1，兩個單位；D2 : BTX-A-2,兩個單位；B4 :BTX-A-1，四個單位；D4 :BTX-A-2,四個單位；B8 :BTX-A-1，八個單 位；和D8 :BTX-A-2,八個單位。
【具體實施方式】
[0022] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域的普 通技術人員的通常理解具有相同的含義。大體上，將在下面描述的本文中使用的命名法和 實驗方法是本領域公知的且通常采用的。
[0023] 在一個方面，本發明涉及一種生產肉毒桿菌毒素方法，該方法包括步驟：(a)用酸 處理肉毒桿菌毒素生產株的培養物，以沉淀肉毒桿菌毒素；(b)向沉淀的肉毒桿菌毒素中 加入緩沖液，接著用蛋白酶抑制劑和核酸酶處理，從而提取肉毒桿菌毒素；（C)用酸處理提 取出的肉毒桿菌毒素以沉淀肉毒桿菌毒素并在緩沖液中溶解沉淀物；和（d)通過陰離子交 換色譜法純化肉毒桿菌毒素（圖1)。
[0024] 通過本發明的方法生產所得的肉毒桿菌毒素可以用各種方法保存，包括冷凍儲藏 和凍干儲藏。
[0025] 本發明的方法可以在步驟（d)后進一步包括步驟：(e)用硫酸銨處理含有肉毒桿 菌毒素的陰離子交換色譜級分，以形成沉淀物，并將沉淀物在緩沖液中溶解；和（f)通過陰 離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素。
[0026] 在本發明中，肉毒桿菌毒素生產株優選肉毒桿菌（Clostridium botul
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生產肉毒桿菌毒素的方法，更具體地涉及一種用于制備肉毒桿菌毒素 的方法，該方法包括步驟：(a)用酸處理肉毒桿菌毒素生產株的培養物，以沉淀肉毒桿菌毒 素；(b)向沉淀的肉毒桿菌毒素中加入緩沖液，接著用蛋白酶抑制劑和核酸酶處理，從而提 取肉毒桿菌毒素；（C)用酸處理提取出的肉毒桿菌毒素以沉淀肉毒桿菌毒素并在緩沖液中 溶解沉淀物；和（d)通過陰離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素。
【背景技術】
[0002] 自19世紀90年代已發現各種分泌神經毒素的梭菌屬（Clostridium sp.) 的菌株，并且在過去的70年已對從這些菌株分泌的毒素進行了表征（Schant，E. J.et al.，Microbiol. Rev.，56:80, 1992)。
[0003] 源自梭菌屬菌株的神經毒素，即肉毒桿菌毒素，根據它們的血清學性質被分為 七種類型（類型A至G)。每種毒素具有約150KDa大小的毒素蛋白并且天然含有幾種 非毒性蛋白的復合物。中等復合物（300kDa)由毒素蛋白和無毒的非血凝素蛋白組成， 大復合物（450kDa)和非常大的復合物（900kDa)由結合到血凝素的中等復合物組成 (Sugiyama, H.，Microbiol. Rev.，44:419, 1980)。已知這種非毒性的血凝素蛋白是用于保護 毒素免受腸道內的低PH值和各種蛋白酶的作用。
[0004] 在細胞中，毒素被合成為具有約150kDa的分子量的單個多肽，然后通過胞內蛋白 酶作用或用人造酶如胰蛋白酶處理，在從N-末端開始的1/3位置裂解成兩個單位：輕鏈 (L ;分子量：50kDa)和重鏈（H ;分子量：100kDa)。相比于單個多肽，裂解的毒素具有大大 增加的毒性。兩個單位通過二硫鍵彼此連接并具有不同的功能。重鏈結合至靶細胞的受體 (Park. Μ. K.，et al·，FEMS Microbiol. Lett. ,72:243,1990)并用于在低 pH 值（pH 4)與生 物膜相互作用，以形成通道（Mantecucco, C. et al.，TIBS.，18:324, 1993)，輕鏈具有藥理活 性，因此通過例如電穿孔導入細胞時，利用洗滌劑賦予細胞滲透性或干擾神經遞質的分泌 (Poulain, B. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 85:4090, 1988) 〇
[0005] 毒素在神經肌肉接頭的膽堿能神經突觸前處抑制乙酰膽堿的胞吐作用，造成乏 力。已認為用非常少量的毒素進行處理展現毒性，這表明毒素具有任何酶活性（Simpson，L. L. et al.，Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol.，26:427, 1986) 〇
[0006] 根據最近的報道，毒素具有金屬肽酶活性，并且其底物由小突觸、突觸融合蛋白、 25KDa的突觸相關蛋白（SNAP25)等組成，它們是胞吐機械復合物的單位蛋白。每種類型的 毒素使用上述三種蛋白質之一作為底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位點裂解小突 觸，A型和E型毒素在特定位點裂解SNAP25,和C型在特定位點裂解突觸融合蛋白（Binz，T. et al.，J. Biol. Chem.，265:9153, 1994) 〇
[0007] 特別是，已知A型肉毒桿菌毒素可溶于pH為4. 0-6. 8的稀釋水溶液。已知穩定的 非毒性蛋白質在PH大約為7或更高時從神經毒素中分離，并且結果是，毒性逐漸喪失。特 別是，已知毒性隨pH和溫度的增加而減少。
[0008] 肉毒桿菌毒素即使少量對人體也是致命的并且易于大量產生。因此，它與炭疽桿 菌、鼠疫和天花病毒一起構成四大生物恐怖武器。然而發現，當A型肉毒桿菌毒素在以不全 身影響人體的劑量注射時，它可以在注射部位使局部肌肉麻痹。根據這個特點，A型肉毒桿 菌毒素可以在廣泛的應用中使用，包括除皺紋藥劑，治療痙攣性偏癱和腦癱的藥劑等。因此 對于A型肉毒桿菌毒素的需求增加，并且已積極地進行對生產肉毒桿菌毒素以滿足該需求 的方法的研究。
[0009] 目前典型的商品化產品是購自美國Allergan公司的BOTOX? (純化的A型肉 毒桿菌毒素的神經毒素復合物）。100單位小瓶的BOTOX?由約5ng的純化的A型肉毒桿 菌毒素的神經毒素復合物，〇. 5mg人血清白蛋白和0. 9mg氯化鈉組成并且用不含防腐劑的 無菌鹽水（注射0.9 %氯化鈉）重構。其他商品化產品包括購自Ipsen Ltd.，UK, MyoBloc? 的:Dysport⑩（A型肉毒桿菌毒素和血凝素的復合物，其在含有肉毒桿菌毒素的藥物組 合物中具有乳糖和人血清白蛋白并在使用前用〇. 9%氯化鈉重構），（可注射溶液（pH 約5. 6)，包含B型肉毒桿菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸鈉和氯化鈉），購自Solstice Neurosciences，Inc.。常規用于生產肉毒桿菌毒素的方法包括酸沉淀法、鹽沉淀法和色譜 法。
[0010] 例如，日本專利公開號1994-192296公開了一種通過培養肉毒梭菌細菌，接著進 行酸沉淀，提取，添加核酸酶和結晶來生產結晶A型肉毒桿菌毒素的方法。此外，美國專利 5696077公開了一種通過培養肉毒梭菌細菌，接著進行酸沉淀，提取，離子交換色譜，凝膠過 濾色譜和結晶來生產結晶B型肉毒桿菌毒素的方法。
[0011] Simpson等人通過重力流色譜，隨后通過HPLC，使用親和樹脂、大小排阻色譜，和 包括使用兩種不同的離子交換柱的離子（陰離子和陽離子）交換色譜的捕獲來純化肉毒神 經毒素，生產A型肉毒桿菌毒素 （Method in Enzymology, 165:76, 1988)，王等人使用沉淀和 離子色譜來純化A型肉毒桿菌毒素 （Dermatol Las Faci Cosm Surg. ,2002:58, 2002)。
[0012] 此外，美國專利6818409公開了使用離子交換和乳糖柱純化肉毒桿菌毒素，和美 國專利號7452697公開了一種通過離子交換色譜和疏水色譜的A型肉毒桿菌毒素。韓國專 利公開號2009-0091501公開了通過酸沉淀和陰離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素的方法， 以及美國公開號2013-0156756公開了通過陰離子交換色譜和陽離子交換色譜純化肉毒桿 菌毒素的方法。
[0013] 然而，傳統方法的問題在于使用陰離子交換色譜不利地影響肉毒桿菌毒素的凝膠 條帶圖案（美國專利號7452697)，并且問題還在于這些常規方法由于純化時間長而難以商 業上應用。另外，由于作為肉毒桿菌毒素生產菌株的肉毒桿菌是一種厭氧細菌，存在著細菌 發酵應在厭氧系統中執行的問題，因此難以大量生產肉毒桿菌毒素。此外，存在著通過上述 純化方法純化的活性成分肉毒桿菌毒素并未清楚地分離和鑒定的問題，并因此含有雜質。 此外，生產肉毒桿菌毒素的傳統方法存在著必需要進行過濾或透析過程以純化高純度的肉 毒桿菌毒素的問題，這表明純化過程是復雜且困難的。
[0014] 因此，本發明人進行了廣泛的努力，以解決現有技術中存在的上述問題，并且結果 發現，當肉毒桿菌毒素生產株的培養物用酸處理以形成肉毒桿菌毒素沉淀物并且通過陰離 子交換色譜純化所形成的沉淀物時，可以省略過濾、透析和乙醇沉淀步驟，并且生產所述肉 毒桿菌毒素的工藝非常容易，并且通過該生產方法可以生產具有98%或更高純度的肉毒桿 菌毒素，從而完成了本發明。
【發明內容】
[0015] 本發明的一個目的是提供一種通過簡單的工藝來生產高純度肉毒桿菌毒素的方 法。
[0016] 為了達到上述目的，本發明提供了用于生產肉毒桿菌毒素的方法，該方法包括以 下步驟：(a)用酸處理肉毒桿菌毒素生產株的培養物，以沉淀肉毒桿菌毒素；(b)向沉淀的 肉毒桿菌毒素中加入緩沖液，接著用蛋白酶抑制劑和核酸酶處理，從而提取肉毒桿菌毒素； (c) 用酸處理提取出的肉毒桿菌毒素以沉淀肉毒桿菌毒素并在緩沖液中溶解沉淀物；和 (d) 通過陰離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素。
【附圖說明】
[0017] 圖1是示出根據本發明的生產肉毒桿菌毒素的過程的示意圖。
[0018] 圖2示出測量通過初級陰離子交換色譜對肉毒桿菌毒素進行純化后的純度結果。
[0019] 圖3示出測量通過二次陰離子交換色譜對肉毒桿菌毒素進行純化后的純度結果。
[0020] 圖4示出測量用本發明方法生產的肉毒桿菌毒素和BOTOX? (Allergan)處 理所造成的復合肌肉動作電位振幅的增加或減少的結果。N :無注射液；S :鹽水注射；B2 : BTX-A-I，兩個單位；D2 :BTX-A-2,兩個單位；B4 :BTX-A-1，四個單位；D4 :BTX-A-2,四個單 位；B8 :BTX-A-1，八個單位；和D8 :BTX-A-2,八個單位。
[0021] 圖5示出測量用本發明方法生產的肉毒桿菌毒素和BOTOSi (Allergan)處 理所造成的傳導速度的結果。N :無注射液；S :鹽水注射；B2 :BTX-A-1，兩個單位；D2 : BTX-A-2,兩個單位；B4 :BTX-A-1，四個單位；D4 :BTX-A-2,四個單位；B8 :BTX-A-1，八個單 位；和D8 :BTX-A-2,八個單位。
【具體實施方式】
[0022] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域的普 通技術人員的通常理解具有相同的含義。大體上，將在下面描述的本文中使用的命名法和 實驗方法是本領域公知的且通常采用的。
[0023] 在一個方面，本發明涉及一種生產肉毒桿菌毒素方法，該方法包括步驟：(a)用酸 處理肉毒桿菌毒素生產株的培養物，以沉淀肉毒桿菌毒素；(b)向沉淀的肉毒桿菌毒素中 加入緩沖液，接著用蛋白酶抑制劑和核酸酶處理，從而提取肉毒桿菌毒素；（C)用酸處理提 取出的肉毒桿菌毒素以沉淀肉毒桿菌毒素并在緩沖液中溶解沉淀物；和（d)通過陰離子交 換色譜法純化肉毒桿菌毒素（圖1)。
[0024] 通過本發明的方法生產所得的肉毒桿菌毒素可以用各種方法保存，包括冷凍儲藏 和凍干儲藏。
[0025] 本發明的方法可以在步驟（d)后進一步包括步驟：(e)用硫酸銨處理含有肉毒桿 菌毒素的陰離子交換色譜級分，以形成沉淀物，并將沉淀物在緩沖液中溶解；和（f)通過陰 離子交換色譜純化肉毒桿菌毒素。
[0026] 在本發明中，肉毒桿菌毒素生產株優選肉毒桿菌（Clostridium botul
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0訪客 來自[中國] 2023年10月28日 20:52你好！你可以提取肉毒素菌種嗎？可以的話請加MB0301，可以合作科研
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