號公開了可用于本發明的測定系統的某些一般目的 的應用流體學（fluidics)工具，允許用相對簡單的硬件精確地操縱氣體、液體和固體以完 成非常復雜的分析操作。
[0107] 在更具體的實例中，一個或多個流通池 （flow cell)可與來自上文的附著基材的 生物樣品連接。流通池可包括與其連接的入口管和出口管并且任選地，外部栗用來將試劑 遞送到流通池并經過生物樣品。流通池被設置為僅將試劑遞送到生物樣品的某些部分，限 制遞送到生物樣品的任何具體部分的試劑的量和類型。
[0108] 在另一個方面，可將微流體系統集成到其上布置生物樣品的基材中或從外部附接 到基材的頂部。用于容納并攜帶流體的微流體管道可通過與基材鄰接的應用流體層形成在 平面基材上和/或其上方。可根據選擇性地開放和關閉布置在試劑池之間的閥來選擇和遞 送流體試劑。
[0109] 栗通常包括用于移動流體和/或設置在流體中的試劑的任何機構。在某些實例 中，栗可被設置成使流體和/或試劑移動經過具有小體積的管道（即，微流體結構）。除了 其他方法外，栗可通過對流體和/或攜帶流體的結構施加正壓或負壓來機械地操作，或通 過電場的適當應用來電動地操作，或兩者兼有。示例性的機械栗可包括注射栗、蠕動栗、旋 轉栗、加壓氣體、移液器等。機械栗可被微型機械化、模制等。示例性的電動栗可包括電極 且可通過電泳、電內滲（electroendoosmosis)、電毛細管、雙向電泳（包括其行波形式）和 /或類似的方法操作。
[0110] 閥通常包括用于調控流體通過管道的任何機構。閥可包括例如，可被選擇性地變 形以部分或完全地關閉管道的可變形的構件，可選擇性地延伸進入通道以部分或完全地堵 塞管道的可移動的突出部，電毛細管結構和/或類似的結構。
[0111] 開口墊圈可與生物樣品的頂部附接并可將樣品和試劑注射到墊圈中。合適的墊圈 材料包括但不限于氯丁橡膠、腈和硅橡膠。可選擇地，防水反應室可由夾在基材上的生物樣 品和化學上惰性的防水材料例如但不限于黑色電鍍鋁、熱塑性塑料（例如，聚苯乙烯、聚碳 酸酯等）、玻璃等之間的墊圈形成。
[0112] 在可選的實施方式中，測定系統包括確定目的生物樣品的特征和組織的成像裝 置。所獲得的圖像例如可用來設計試劑的安置模式。成像裝置是任選的，因為人們可使 用例如顯微鏡來代替觀察生物樣品，分析生物樣品的組織并具體說明遞送測定試劑的空 間模式。遞送系統（如果包括的話）可包含微電路構造，所述微電路構造包括成像器例 如基于C⑶或IGFET(例如，基于CMOS)的成像器和例如通過引用并入本文的美國公布第 20090197326號中描述的用于試劑遞送的超聲噴霧器。另外，應注意雖然圖4和5使用x，y 網格構型闡述，可使用其他構型，諸如，例如遵循組織樣品的拓撲學；靶向組織中的某些組 的細胞、細胞層和/或細胞類型，及類似的構型。
[0113] 在又一個替代方案中，試劑遞送系統使用半導體技術例如掩蔽和噴涂控制試劑遞 送到生物樣品表面上的具體模式。通過使用掩蔽物保護特定區域免于暴露，可避免生物樣 品的特定區域暴露于試劑。可使用傳統技術例如噴涂或流體流將試劑引入到生物樣品。掩 蔽遞送的使用促成基材表面上模式化的遞送方案。
[0114] 在本發明的優選的方面，試劑遞送的設備基于噴墨印刷技術。存在多種不同的噴 墨機制（例如，熱式、壓電式）且已顯示與含水墨制劑和有機墨制劑的相容性。數組獨立驅 動的噴嘴可用來同時遞送多種試劑，并達到非常高的分辨率。
[0115] 為了靶向特定的目的位點，待測定的生物樣品的信息圖像可用來輔助試劑遞送方 法及相關的編碼方案。可使用圖像處理（例如，通過免疫組織化學或其他染色化學方法區 分的細胞類型的圖像）結合測定系統的其他特征來鑒定生物樣品的取樣區域。在某些方 面，使用軟件將圖像信息自動翻譯成試劑遞送模式。因此非常準確地記錄并比對生物樣品 的試劑遞送的機構（mechanism)是本發明的測定系統的重要組成部分。機構例如在載玻片 上的基準標志（fiducial marker)和/或其他非常精準的物理定位系統的使用可適用于該 目的。
[0116] 本發明優選地包括一整套適合該測定系統的軟件。任選地，寡核苷酸設計軟件用 來設計待進行特定測定的編碼核苷酸（且在其中測定核酸的實施方式中，為靶特異性寡核 苷酸）并可被集成為該系統的一部分。還任選地，可將用于試劑遞送和數據分析（即，序列 分析）的算法和軟件集成在一起以確定測定結果。集成數據分析是特別有用的，因為由于 規模的結果，所產生的數據組的類型可能是巨大的。為分析通過該測定系統產生的空間上 關聯的數據而專門設計的算法和軟件工具，包括模式分析軟件和可視工具增強了由該測定 系統所產生的數據的價值。
[0117] 在某些方面，該測定系統包含用于進行和實施試劑質量控制例如，寡核苷酸庫的 完整性和序列保真性的程序。特別地，根據例如揮發性、在關鍵溫度下的穩定性及化學相容 性的因素配制試劑以與試劑遞送設備相容并可通過集成在測定系統內的設備來分析這些 試劑。
[0118] 測序
[0119] 許多方法可用來鑒定本發明的測定系統的編碼探針中的代碼標簽和探針序列。可 使用例如質譜（例如，LC-MS/MS的Maldi-T)、核磁共振成像或優選地，核酸測序的技術來檢 測代碼標簽。用于對本發明的代碼標簽解碼的技術的實例可在例如通過引用并入本文的美 國公布第20080220434號中找到。例如，代碼標簽可以是寡核苷酸質量標簽（0ΜΤ或質量標 簽）。例如，在通過引用整體并入本文的美國公布第20090305237號中描述了這些標簽。在 又一個替代方案中，可擴增編碼探針并與微陣列雜交。這將需要進行單獨的擴增反應，其中 每次擴增是對特定的空間代碼或代碼的子集特異的，通過使用代碼特異性引物來實現。每 次擴增還將并入不同的可分辨標記（例如，熒光團）。雜交后，可通過可分辨標記的相對豐 度測定映射到樣品中不同的空間位置的特定靶的相對量。
[0120] 在一個特別優選的方面，所得的根據該測定系統的代碼標簽是高通量、下一代 測序的底物，并使用高并行下一代測序方法來確認代碼標簽的序列，例如用SOLiD?技 術(Life Technologies, Inc.)或 Genome Ananlyzer(Illumina，Inc.) 〇 該下一代測 序方法可使用例如一輪測序（one pass sequencing)方法或使用雙末端測序進行。下 一代測序方法包括但不限于諸如在例如Drmanac美國專利第6, 864, 052 ;6, 309, 824 ; 和6,401，267號；和Drmanac等人，美國專利公布2005/0191656中公開的基于雜交的 方法；通過合成測序（sequencing-by-synthesis)的方法，例如美國專利第6, 210, 891 ; 6, 828, 100 ；6, 969, 488 ；6, 897, 023 ；6, 833, 246 ；6, 911, 345 ；6, 787, 308 ；7, 297, 518 ； 7, 462, 449 和 7, 501, 245 號；美國公布申請第 20110059436 ;20040106110 ;20030064398 和 20030022207 號；Ronaghi,等人，Science,281:363-365 (1998);和 Li,等人，？『〇。· Natl. Acad. Sci.，100:414-419(2003);基于連接的方法，例如美國專利第5, 912, 148和 6, 130, 073 號；和美國專利申請第 20100105052、20070207482 和 20090018024 號；納米 孔測序例如美國專利申請第 20070036511 ;20080032301 ;20080128627 ;20090082212 號； 和Soni和Meller, Clin Chem 53:1996-2001(2007))，以及其他方法，例如美國專利申請 第 20110033854 ;20090264299 ;20090155781 和 20090005252 號；還參見 McKernan,等 人，Genome Res. ,19:1527-41 (2009)和 Bentley,等人，Nature 456:53-59 (2008)，為了所 有目的將所有這些文獻通過引用整體并入本文。
[0121] 測定系統的應用
[0122] 在閱讀本公開內容后將對于本領域技術人員明顯的是：存在將受益于可同時測量 生物靶在生物樣品中的量和空間位置的高通量多重測定系統的許多重要的生物研究、診斷 和藥物開發的領域。例如，組合估計不同RNA轉錄物的相對豐度的能力和重新構建遍及許 多位置的豐度的空間模式的圖像（可能和組織中的單個細胞一樣小或甚至比它還小）的能 力使得許多不同的基礎研究領域成為可能。以下是示例性的用途且絕不意味著在范圍上是 限制性的。
[0123] 在一個實例中，以與CT掃描中的重新構建圖像的方式相似的方式通過分析一系 列的組織切片確定基因表達的3維模式。該方法可用來測量疾病病理中例如在癌性組織和 /或經損傷、炎癥或感染的組織中基因表達的變化。通過本發明的測定系統，獲得了關于復 雜組織中的基因表達和蛋白質定位的更詳細的信息，導致對正常和疾病狀態中的功能和調 控的新認識，并提供了可被檢驗的新假設。例如，本發明的測定系統可使得從許多單獨的研 究和較大的項目如 ENCODE (Birney,等人，Nature, 447:799-816 (2007))和 modENCODE 獲得 的認識能夠在組織水平上整合。該測定系統還輔助計算機嘗試來模仿系統生物學領域基因 表達的相互作用網絡。
[0124] 該測定系統還提供了分析體細胞變異例如癌癥中的體細胞突變或響應于受感染 的生物體的變異性的新方法。例如，腫瘤通常是高度異質性的，包含癌細胞以及在異常局部 環境中的遺傳學上正常的細胞。癌細胞進行突變和選擇，且在該過程中形成局部克隆并不 是不常見的。在腫瘤環境中鑒定相對稀少的體細胞突變可使得研究關鍵突變在克隆變異體 的選擇中的作用成為可能。可分析在癌細胞和遺傳學上正常的細胞中與血管生成、炎癥或 其他癌相關過程有關的轉錄模式以獲得對癌癥生物學的認識并有助于開發用于治療癌癥 的新型治療劑。在另一個實例中，個體對感染性生物體具有不同的敏感性，且本發明的測定 系統可用來研究微生物與組織或組織內的多種細胞類型之間的相互作用。
[0125] 重要的是，因為在任何給定的反應中由于只測定了少數位置，信噪比（signal to noise)可急劇增加，所以除了提供空間上相關的信息，本發明允許檢測稀少突變的靈敏性 大幅增加。在對混合的樣品中的稀有突變的典型測定中，批量處理該樣品，即，將核酸從許 多細胞提取到單一的池中。因此，如果突變存在于10, 〇〇〇個細胞中的一個細胞內，必須針 對來自~10, 〇〇〇個細胞的正常DNA的背景檢測該突變。相比之下，通過本發明的測定系統， 可分析許多細胞，但是單獨的細胞或少數幾組細胞將被空間代碼系統鑒定。因此，在本發明 的測定系統中，背景成數量級地減少，極大地增加了靈敏性。此外，可觀察突變細胞的空間 組織，這對于在癌癥組織切片中檢測關鍵突變可能是特別重要的。已有的分子組織學分析 正在產生對癌癥生物學的認識，且可能具有用于診斷的潛力。本發明的技術有希望極大地 增加這些方法的力量。
[0126] 實施例
[0127] 提供以下實施例以給本領域普通技術人員提供如何實施和使用本發明的完整公 開和描述，且這些實施例不意在限制發明人所認為的其發明的范圍，這些實施例也不意在 代表或意味著以下實驗是所進行的全部實驗或僅有的實驗。本領域技術人員應理解可如具 體實施方式中展現的那樣對本發明進行許多改變和/或修改而不偏離寬泛地描述的本發 明的精神或范圍。因此，無論在哪個方面，應認為該實施方式是說明性而不是限制性的。
[0128] 已經進行努力以確保關于所使用的數字（例如，量、溫度等）的準確性但是