空間編碼的生物學測定的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2011年4月5日，申請號為201180017696. 3,發明名稱為"空 間編碼的生物學測定"的申請的分案申請。
[0002] 相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2011年4月5日遞交的美國專利申請第13/080,616號和2010年4 月5日遞交的美國臨時專利申請第61/321，124號的權益并被本文通過引用并入。
技術領域
[0004] 本發明涉及生物分子的測定，且更具體地涉及用于同時確定大量生物分子在固體 樣品中的空間分布的測定。
【背景技術】
[0005] 在以下討論中，將為了背景和介紹的目的描述某些制品和方法。本部分包含的任 何內容都不應被解釋為"承認"是現有技術。申請人明確地保留在適當的時候，根據適用的 法律條文證實本文述及的制品和方法不構成現有技術的權利。
[0006] 全面的基因表達分析和蛋白質分析已成為理解生物學機制的有用工具。這些工 具的使用已促進參與發育和各種疾病例如癌癥和自身免疫病的基因和蛋白質的鑒定。傳 統方法例如不同轉錄物的原位雜交和其他多重檢測已揭示出基因表達的空間模式并已幫 助闡明發育和疾病的分子基礎。使得能夠定量分析每個樣品的許多RNA序列的其他技術 包括微陣列（參見，Shi,等人，Nature Biotechnology，24(9):1151_61(2006);及 Slonim 和 Yanai, Plos Computational Biology, 5(10): e100 0543 (2009));基因表達的系列分析 (SAGE)(參見 Velculescu,等人，Science, 270(5235) :484-87(1995))、qPCR 的高通量實 現（參見 Spurgeon,等人，Plos ONE, 3(2): el662 (2008))和原位 PCR(參見 Nuovo, Genome Res.，4:151-67 (1995))。盡管這些方法是有用的，但是它們不能在樣品中的許多空間位置 同時測量許多基因的表達或多種蛋白質的存在和/或活性。激光捕獲顯微切割已允許在少 數位置分析許多基因，但是其非常昂貴、費力且不能很好地調整。雖然某些2D格式的PCR 測定保留了空間信息（參見Armani,等人，Lab on a Chip, 9 (24) :3526-34 (2009))，但是這 些方法具有低的空間分辨率，因為它們依賴于向孔中物理轉移組織，這還阻止了隨機接近 組織樣品和高水平的多重檢測（multiplexing)。
[0007]目前，不存在以高分辨率同時分析大量的基因、蛋白質或其他生物活性分子的空 間表達模式的運行方法。因此存在對組織中的生物分子的可重現的、高分辨率的空間圖譜 的需要。本發明解決了該需要。
【發明內容】
[0008] 提供該概述以便以簡化的方式介紹以下在詳述中進一步描述的概念的節選。該概 述不旨在確定要求保護的主題的關鍵或必不可少的特征，也不旨在用來限制所要求保護的 主題的范圍。從隨后的包括在附圖中示出并在所附權利要求中定義的那些方面的書面詳述 中，所要求保護的主題的其他特征、細節、實用性和優點將是明顯的。
[0009] 本發明包括提供組織中生物活性的高分辨率空間圖譜的測定系統。該測定系統包 含能夠高水平多重檢測的測定，其中以指定的空間模式為生物樣品提供編碼探針；能夠根 據該空間模式控制遞送試劑的設備；和提供本質上為數字的讀出的解碼方案。簡言之，本發 明提供了觀看許多位置中的許多生物靶的能力，提供了以高度并行的測序數據分析對原位 雜交的分辨。
[0010]因此，在某些實施方式中，本發明提供了確定多種生物靶在樣品中的多個位點的 豐度或活性或兩者的空間模式的測定系統，其中該測定系統進行下列步驟：提供附著到支 持體的樣品；以已知的空間模式將用于多種生物靶的編碼探針遞送到樣品中的多個位點， 其中每個編碼探針包含可與生物靶相互作用的探針區域和確定編碼探針被遞送的位點的 位置的代碼標簽（coding tag);促使編碼探針與生物靶相互作用；將與生物靶相互作用的 編碼探針和未與生物靶相互作用的編碼探針分離；測定編碼探針的序列的全部或一部分， 以及將多種生物靶的豐度或活性或兩者與樣品中的位點的位置相關聯。
[0011] 在本發明特定的方面，生物靶包含核酸且編碼探針是寡核苷酸，且在某些方面，對 于多種核酸靶中的每一種存在兩種編碼的探針。在某些方面，多種生物靶包含蛋白質，編碼 探針的探針區域是蛋白質且代碼標簽包含寡核苷酸。在某些方面，多種生物靶包含酶。在 某些方面，編碼探針的探針區域包含抗體、適體或小分子。
[0012] 在本發明特定的方面，所述生物靶可以是核酸且所述編碼探針可以是寡核苷酸。 優選地，其中對于多種核酸靶中的每一種可存在兩種編碼探針。
[0013] 在本發明特定的方面，所述多種生物靶可以是蛋白質，所述編碼探針的所述探針 區域可以是蛋白質且所述代碼標簽可包含寡核苷酸。優選地，其中所述多種生物靶可包含 酶。
[0014] 測定系統的某些方面還在分離步驟和測定步驟之間包含擴增步驟。在某些方 面，測定步驟通過核酸測序進行，且在優選的方面，測序是高通量數字核酸測序（high throughput digital sequencing)〇
[0015] 在本發明的某些方面，被測定的多種生物靶和樣品中的多個位點的乘積大于20， 在某些方面，被測定的多種生物靶和樣品中的多個位點的乘積大于50,在某些方面，被測 定的多種生物靶和樣品中的多個位點的乘積大于75、100、150、500、750、1，000、5, 000、 10, 000、25, 000、50, 000、100, 000、500, 000 或 1，000, 000 或更大。在其他方面，并行測定 至少五萬個編碼探針的序列，在其他方面，并行測定至少十萬個編碼探針的序列，在某些方 面，并行測定至少五十萬個編碼探針的序列，且在某些方面，并行測定至少一百萬、一千萬、 一億、十億、一百億、一千億或更多個編碼探針的序列。
[0016] 在某些方面，已知的空間模式通過樣品的組織學特征確定。還在某些方面，軟件程 控的硬件進行遞送步驟、分離步驟、測定步驟和關聯步驟中的至少兩個步驟。
[0017] 在某些方面，編碼探針的探針區域是蛋白質且分離步驟通過用親和捕獲劑捕獲與 生物靶相互作用的編碼探針實現。在某些方面，編碼探針的探針區域是核酸且分離步驟通 過洗滌樣品實現。
[0018] 在其他實施方式中，提供了測定多種核酸靶在樣品中的多個位點的豐度或活性或 兩者的空間模式的測定系統，其中該測定系統進行以下步驟：提供附著到支持體的樣品； 以已知空間模式將用于多種核酸靶的寡核苷酸探針遞送到樣品中的多個位點；促使寡核苷 酸探針與核酸靶雜交；從樣品中洗掉未雜交的編碼寡核苷酸探針；根據已知空間模式將一 種或多種編碼劑（encoding agent)遞送到樣品中的多個位點的位置，其中遞送到每個位點 的編碼劑的組合是不同的；將編碼劑和寡核苷酸探針偶聯以形成編碼探針；使用高通量測 序測定編碼探針的序列的全部或一部分，以及將多種生物靶的豐度或活性或兩者與樣品中 多個位點的位置相關聯。
[0019] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于20。
[0020] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于50。
[0021] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于75。
[0022] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于 10, 000。
[0023] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于 100, 000〇
[0024] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于 1，000, 000〇
[0025] 在某些方面，至少十萬個編碼探針的序列可被并行測定。
[0026] 在某些方面，至少一百萬個編碼探針的序列可被并行測定。
[0027] 在某些方面，對于所述多種核酸靶中的每一種可遞送兩種寡核苷酸探針。
[0028] 在某些方面，所述偶聯步驟可通過連接進行。
[0029] 在某些方面，所述偶聯步驟可通過延伸然后連接進行。
[0030] 在某些方面，還可在所述偶聯步驟和所述測定步驟之間包含擴增步驟。
[0031] 本發明的其他實施方式提供了測定多種蛋白質靶在樣品中的多個位點的豐度或 活性或兩者的空間模式的測定系統，其中該測定系統進行以下步驟：提供附著到支持體的 樣品；以已知空間模式將用于多種蛋白質靶的編碼探針遞送到樣品中的多個位點，其中每 個編碼探針包含可與蛋白質靶相互作用的蛋白質探針區域和確定編碼探針被遞送的位點 的位置的代碼標簽，且代碼標簽是編碼探針的蛋白質探針區域的一部分；促使編碼探針與 蛋白質靶相互作用；將與蛋白質靶相互作用的編碼探針和未與蛋白質靶相互作用的編碼探 針分離；通過高通量測序測定編碼探針的序列的全部或一部分，以及將多種蛋白質靶的豐 度或活性或兩者與樣品中的多個位點的位置相關聯。
[0032] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于20。
[0033] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于50。
[0034] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于75。
[0035] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于 IOOo
[0036] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于 500。
[0037] 在某些方面，被測定的所述多種生物靶與所述樣品中的所述多個位點的乘積可大 于 1000。
[0038] 在某些方面，至少一萬個編碼探針的序列可被并行測定。
[0039] 在某些方面，至少十萬個編碼探針的序列可被并行測定。
[0040] 在某些方面，至少一百萬個編碼探針的序列可被并行測定。
[0041] 在某些方面，還可在所述偶聯步驟和所述測定步驟之間包含擴增步驟。
[0042] 在某些方面，所述蛋白質靶可以是酶，且所述編碼探針的所述探針區域可以是酶 的底物、推定底物或兩者。
[0043] 在某些方面，所述編碼探針的所述探針區域可以是親和捕獲劑。優選地，所述編碼 探針的所述探針區域可以是抗體。優選地，所述編碼探針的所述探針區域可以是適體。
[0044] 在某些方面，將與所述蛋白質靶相互作用的編碼探針和未與所述蛋白質靶相互作 用的編碼探針分離可通過親和捕獲劑實現，所述親和捕獲劑區分與所述蛋白質靶相互作用 的編碼探針和未與所述蛋白質靶相互作用的編碼探針。
[0045] 在某些方面，所述代碼標簽可以是寡核苷酸。
[0046] 其他實施方式提供了測定多種生物靶在樣品中的多個位點的豐度或活性或兩者 的空間模式的測定系統，其中該測定系統進行以下步驟：提供附著到支持體的樣品；以已 知空間模式將用于多種生物靶的編碼探針遞送到樣品中的多個位點，其中每個編碼探針包 含可與生物靶相互作用的探針區域和確定編碼探針被遞送的位點的位置并鑒定生物靶的 代碼標簽；促使編碼探針與生物靶相互作用；測定編碼探針的序列的全部或一部分，以及 將多種生物靶的豐度或活性或兩者與樣品中位點的位置相關聯。
[0047] 基于待檢測的分子和該檢測系統所需要的試劑，本發明的測定系統可采用多種檢 測機制。以下更詳細地描述了可用于本發明的測定系統的示例性的方法。
【附圖說明】
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