、PSV序列（YC2011)保守基因 和SAV序列Cowden(AF182760)VPl基因設計3對引物（表1)。
[0031] 表1多重RT-PCR引物設計結果
[0032]
[0033] 2)病料的處理
[0034] 用IOmmol · L 1PBS緩沖液將糞樣稀釋10倍，在渦旋儀上振蕩混勻5min后， 12000r · min 1離心5min，取上清液備用。
[0035] 3) RNA 的提取
[0036] 取200 μ 1樣品加入1ml RNAiso Plus，劇烈振蕩后，室溫靜置5min ;加入200 μ 1氯 仿，劇烈振蕩，冰上靜置l〇min，4°C、12000r ·ηι in 1離心15min ;離心后取上清400 μ 1加入 等體積異丙醇，輕輕混勾后，冰塊上靜置l〇min，4°C、12000r · min 1離心10min ;棄上清，向 沉淀中加入1000 μ 1 75%的冰乙醇（由無水乙醇與DEPC水配制）；輕輕混勻，室溫下靜置 8min后于4°C、8000r ·η?η 1離心5min，棄上清，自然干燥，管底沉淀即為總RNA，加入10~ 20 μ I RNase-free水溶解沉淀，即為所提取RNA模板。
[0037] 4) 一步法反轉錄及PCR擴增反應
[0038] 反應體系為 50 μ I :PrimeScript lstep Enzyme Mix (內含 Prime Script Reverse Transcriptase、TaKaRa Ex Taq Hot Start 及 RNase In hibitor)2 μ1、2X lstep Buffer(內含反應 Buffer 和 dNTP Mixture(終濃度 400 μΜ))25 μ 1、上游引物 (10 μΜ) 1 μ 1、下游引物（10 μΜ) 1 μ 1、模板 RNA 5 μ 1，加 DEPC 水至 50 μ 1。
[0039] 反應參數為：5〇Γ 3〇min ;94°C 2min ;94°C 3〇sec，55°C 3Ose c，72°C 3Osec,35 個 循環；循環結束后再72°C lOmin。
[0040] 5)多重RT-PCR反應條件優化
[0041] 單項PCR最佳退火溫度和引物濃度的確定，將退火溫度設定為51. 0、51. 5、52. 4、 53. 8、55. 5、56. 8、57. 6、58. (TC 8個梯度；將上下游引物分別稀釋成濃度為10 μ M，分別加入 0· 2、0· 35、0· 5、0· 75、1· 0、1· 2、1· 35 和 L 5 μ 1，模板都為 RNA 5 μ 1 不變。
[0042] 采用不同的退火溫度進行PCR擴增（圖1)，退火溫度確定為53. 8~56. 8°C;引物 濃度范圍為1.0~1.5 μ 1(圖2)。
[0043] 根據確定的單項PCR反應引物濃度及退火溫度，逐步篩選出多重PCR反應體系中 3對引物的最佳濃度及退火溫度。
[0044] 3對引物的上、下游引物分別為I. 0、1. 2、1. 35和1. 5 μ 1時進行不同組合和不同退 火溫度（53. 0、53. 8、54. 5、55. 0、55. 5、56. 0、56. 8、57. 5°C )條件下，逐步優化引物濃度，最 終確定多重PCR引物最佳濃度：PEDV 1.2 μ 1、PSV 0.75 μ 1和SAV 1.0 μ 1，最佳退火溫度為 55. 5°C (圖 3)。
[0045] 實施例2多重PCR特異性試驗
[0046] 分別取 PEDV、PSV 和 SAV 混合 RNA 模板、PEDV-TGEV-GAR V 三聯弱毒株 RNA、PSV、 SAV、CSFV、PRRSV RNA 模板，PCV2、PRV、PPV DNA 模板以及 H20 進行多重 PCR 反應。模板 DNA 的反應體系為：TaKaRa Ex Taq Hot Start(5units/yl)0.25yl、10XEx Buffer 5μ1、 dNTP Mix(2.5mM each)4yl、上游引物和下游引物（ΙΟμΜ)各ΙμL、模板DNA 5μ1并補加 DEPC 水至 50 μ 1。反應參數為：94°C 3min ;94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 個循環； 循環結束后再72°C IOmin。
[0047] 用已確定的多重RT-PCR反應條件對PEDV、PSV和SAV混合R NA模板、 PEDV-TGEV-GARV 三聯弱毒疫苗 RNA、PSV、SAV、CS FV、PRRSV RNA 模板，PCV2、PRV、PPV DNA 模板以及H2O進行多重PCR擴增，結果如圖4所示，只有PEDV、PSV和SAV混合RNA模板和 PEDV、PSV、SAV RNA模板擴增出與目的片斷大小一致的條帶，其它模板均無條帶。
[0048] 實施例3多重RT-PCR的敏感性
[0049] PEDV、PSV 和 SAV 三種 RNA 濃度分別為 86 μ g .mL \41 μ g .mL 1 和 0· 72 μ g .mL \ 在優化的RT-PCR反應條件下，對以上模板RNA分別作10倍倍比（10°~IO7)稀釋，結果如圖 5所示，PEDV的最高敏感度為43pg、PSV的最高敏感度為21pg、SAV的最高敏感度為36pg。
[0050] 實施例4多重RT-PCR檢測方法的初步臨床應用
[0051] 利用多重RT-PCR和常規RT-PCR檢測了 78份腹瀉豬糞樣，并對兩種檢測方法進行 比較。
[0052] 結果如表2所示，多重RT-PCR與常規單項RT-PCR整體臨床樣品檢測符合率達 98. 2%，PEDV、PSV和SAV的單項符合率分別為100%、100%、80%，特異性為100%，表明建 立的PEDV、PSV和SAV多重RT-PCR檢測方法敏感性高、特異性強；PEDV、PSV和SAV的陽性 率分別為56. 4%、7· 7%和6. 4%。
[0053] 表2多重RT-PCR與常規單項RT-PCR臨床樣品檢測結果比較
[0055] 實施例5多重RT-PCR產物測序及序列比對
[0056] 將PEDV、PSV和SAV多重RT-PCR臨床檢測的陽性PCR產物送蘇州金唯智生物技術 有限公司測序，測序結果利用NCBI中的BLAST軟件進行序列比對。
[0057] 試驗基于本發明3對引物，應用一步法多重RT-PCR技術在同一體系中擴增出659、 428、246bp的特異性片斷。應用本研究建立的方法對實施例4中78份臨床病料進行檢測，檢 出PEDV、PSV和SAV的陽性率分別為56. 4%、7. 7%和6. 4%。將3份陽性樣品的多重RT-PCR 產物送蘇州金唯智生物技術有限公司測序，測序結果利用NCBI中的BLAST軟件進行序列比 對，結果顯示，3份樣品的PEDV的Sl基因序列與參考毒株（cv777)的同源性達88. 2 %~ 93. 7%，PSV的相應保守基因序列與參考毒株（YC2011)的同源性達98. 2%~99. 1%，SAV 的VPl基因序列與參考毒株（Cowden)的同源性達95. 5%~98. 3%。測序結果進一步證實 建立的多重RT-PCR方法具有較好的特異性，可用于臨床樣品檢測。
【主權項】
1. 一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：包括引物組合 物：PEDV-P1 :5'-CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 :5' -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ； PSV-P1 :5' -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3'、PSV-P2 :5'-GCCCTGCACAACTGCTTTC-3' ；SAV-P1 : 5' -TACGGGGGAATAGGTTT-3'、SAV-P2 :5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。2. 根據權利要求1所述的一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，其特 征在于：所述的RT-PCR檢測的反應體系為為：PrimeScriptlstepEnzymeMix2μ1、2Χ 1st印Buffer25μ1、10μΜ上游引物各1μ1、10μΜ下游引物各ΙμL、模板RNA5μ1，加 DEPC水至 50μ1。3. 根據權利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，其特征 在于：反應條件具體為：50°C30min;94°C2min;94°C30sec，55°C30sec，72°C30sec，35 個 循環；循環結束后再72°ClOmin。4. 根據權利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒， 其特征在于：所述的PrimeScriptlstepEnzymeMiX內含PrimeScriptReverse Transcriptase、TaKaRaExTaqHotStart及RNaseInhibitor。5. 根據權利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，其特征 在于：所述的Buffer內含反應Buffer和dNTPMixture，終濃度為400μM。6. 根據權利要求1~5中任一項所述的一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試 劑盒，其特征在于：所述的豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒、豬薩佩羅病毒和豬札幌 病毒。7. -種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的引物組合物，其特征在于：所述的引物組合物 包括：PEDV-P1 :5'-CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 :5' -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ； PSV-P1 :5' -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3'、PSV-P2 :5'-GCCCTGCACAACTGCTTTC-3' ；SAV-P1 : 5' -TACGGGGGAATAGGTTT-3'、SAV-P2 :5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。
【專利摘要】本發明公開了而一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，包括引物組合物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1～6所示，本發明建立的PEDV、PSV、SAV一步法多重RT-PCR檢測方法，特異性強，敏感度高，將RT和PCR兩步反應一步進行，既節省了時間和步驟，同時也大大減少了對RNA的污染和降解機率，可以在同一體系中同時檢測3種引起豬腹瀉的病毒，大大降低了檢測成本，為臨床上病原感染性調查研究提供了簡便、快速和準確的檢測方法，具有重要的實際應用價值。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號】CN105385683
【申請號】CN201510288383
【發明人】蔣春燕, 劉永杰, 張曉菊, 張超穎, 吳亞鋒
【申請人】蔣春燕
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年6月1日