一種豬流行性腹瀉病毒的多重rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物監測技術領域，涉及一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測 試劑盒，具體為針對PEDV、PSV和SaV -步法三重RT-PCR的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 近年來仔豬腹瀉病廣泛流行于全國各地，患病仔豬發病率、死亡率均高達80%以 上，給養豬業造成嚴重的經濟損失。冠狀病毒科豬流行性腹瀉病毒（PHW)、傳染性胃腸炎 病毒（TGEV)以及呼腸孤病毒科豬A群輪狀病毒（GARV)是導致豬腹瀉的三種主要病毒性 病原。在腹瀉病因的調查中常呈混合感染，關于這三種病毒的多重檢測方法有很多文獻報 道。另據文獻報道豬博卡病毒（PBoV)、豬薩佩羅病毒（PSV)和豬札幌病毒（SaV)可以引起 豬的腹瀉，但相對文獻報道較少也沒有引起足夠的重視。PSV是單股正鏈RNA病毒，屬于小 RNA病毒科，《病毒分類-國際病毒分類委員會（ICTV)第八次報告》最終將其命名為薩佩 羅病毒屬，該屬包括豬薩佩羅病毒、禽薩佩羅病毒和猿薩佩羅病毒。該病毒能引起中度或 嚴重的神經系統紊亂、腹瀉、繁殖障礙和肺炎。PSV能在豬腸道上皮細胞繁殖，并隨著糞便 排出體外，使該病毒在環境中大量存在，感染豬在康復后可繼續排毒，因此在飼養豬群中感 染率較高。該病毒若與其他病原如豬瘟病毒（CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)以 及豬細小病毒（PPV)等混合感染，將造成病豬嚴重的臨床癥狀。豬腸道杯狀病毒（Porcine enteric calicivirus，PECV)包括豬諾如病毒（norovirus，NoV)和豬札幌病毒（Porcine sapovirus，SaV)。豬NoV只感染成年豬，且無臨床癥狀；而豬SaV感染各年齡的豬尤其斷奶 仔豬，并引起仔豬腹瀉，給養殖業帶來一定損失。SaV分為5個基因群（GI-GV)，其中GIII 為豬SaV，其余為人SaV，世界首例豬SaV(Sw/SV/Cowden/80/US)于1980年在美國報道，英 國、委內瑞拉和韓國等國家也陸續有暴發該病的報道，黃澤彬等于2009年首次報道該病也 存在于我國的豬群中。
[0003] 多重PCR是在同一反應體系中加入多對引物對多個目的基因同時進行擴增的試 驗方法。該項技術具有省時、省力、降低成本、減少產物污染等優點。多重PCR能夠捕獲更 多的信息，使應用范圍更加廣泛，分析的基因更加復雜。因此建立一種能夠同時檢測PEDV、 PSV和SaV多重RT-PCR方法有助于快速鑒別診斷疾病。
【發明內容】
[0004] 本發明目的在于立一種快速、敏感的鑒別診斷PEDV、PSV和SaV多重RT-PCR檢測 方法。
[0005] 本發明具體通過以下技術方案實現：
[0006] 一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，包括引物組合物： PEDV-Pl :5' -CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 :5' -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ； PSV-Pl :5' -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3'、PSV-P2 :5' -GCCCTGCACAACTGCTTTC-3' ；SAV-P1 : 5' -TACGGGGGAATAGGTTT-3'、SAV-P2 :5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。
[0007] 本發明所述的RT-PCR檢測的反應體系為為：PrimeScript lstep Enzyme Mix (內含 PrimeScript Reverse Transcriptase、TaKaRa Ex Taq Hot Start 及 RNase Inhibitor)2yl、2X lstep Buffer(內含反應 Buffer 和dNTP Mixture(終濃度 400 μ M) )25 μ 1、上游引物（10 μ M)各I μ 1、下游引物（10 μ M)各I μ 1、模板RNA 5 μ 1，加 DEPC 水至 50 μ 1。
[0008] 針對上述反應體系，反應條件具體為：50°C 30min ;94°C 2min ;94°C 30sec， 55°C 30sec，72°C 30sec，35 個循環；循環結束后再 72°C IOmin0
[0009] 本發明所述的引物組合物根據GenBank收錄的PEDV序列（CV777) SI基因、PSV序 列（YC2011)保守基因和SAV序列Cowden(AF182760)VPl基因設計得到。
[0010] 本發明還提供了一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0011] 1)病料的處理：用IOmmol · L 1PBS緩沖液將糞樣稀釋10倍，在渦旋儀上振蕩混勻 5min后，12000r · min 1離心5min，取上清液備用；
[0012] 2)RNA的提取：將樣品分別依次利用氯仿、異丙醇萃取離心，棄上清，在沉淀中加 入冰乙醇混勻，室溫下靜置，沉淀即為總RNA ;
[0013] 3) RT-PCR反應體系的建立
[0014] 反應體系為 50 μ I :PrimeScript lstep Enzyme Mix (內含 Prime Script Reverse Transcriptase、TaKaRa Ex Taq Hot Start 及 RNase In hibitor)2 μ1、2X lstep Buffer(內含反應 Buffer 和 dNTP Mixture(終濃度 400 μΜ))25 μ 1、上游引物 (10μΜ)1μ1、下游引物（10μΜ)1μ1、模板RNA 5μ1，加 DEPC水至 50μ1 ;
[0015] 反應參數為：5〇Γ 3Omin ;94°C 2min ;94°C 3〇sec，55°C 3Ose c，72°C 3Osec,35 個 循環；循環結束后再72°C IOmin ;
[0016] 4)擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳判定結果。
[0017] 本發明的另一目的在于提供一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的引物組 合物，所述的引物組合物包括：PEDV-P1 :5' -CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 : 5, -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ；PSV-P1 :5, -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3，、PSV-P2 : 5? -GCCCTGCACAACTGCTTTC-3, ；SAV-P1 -TACGGGGGAATAGGTTT-3 \ SAV-P2 ： 5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。
[0018] 本發明所述的豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒、豬薩佩羅病毒和豬札幌病 毒。
[0019] 本發明的有益效果為：本發明建立的PEDV、PSV、SAV-步法多重RT-PCR檢測方法， 特異性強，敏感度高，將RT和PCR兩步反應一步進行，既節省了時間和步驟，同時也大大減 少了對RNA的污染和降解機率，可以在同一體系中同時檢測3種引起豬腹瀉的病毒，大大降 低了檢測成本，為臨床上病原感染性調查研究提供了簡便、快速和準確的檢測方法，具有重 要的實際應用價值。
【附圖說明】
[0020] 圖1是PEDV、PSV和SAV單項RT-PCR不同退火溫度的電泳圖；M. DNA標準DL2000 ; 1 ~8、9 ~16 和 17 ~24 的 Tm 值分別為 51. 0、5L 5、52. 4、53. 8、55. 5、56. 8、57. 6、58. (TC 8 個梯度；1~8為等量PEDV RNA模板；9~16 :為等量PSV RNA模板；17~24 :為等量SAV RNA模板；
[0021] 圖2是PEDV、PSV和SAV單項RT-PCR不同引物濃度的電泳圖；M. DNA標準DL2000 ; 1~8、9~16和17~24加入的引物量分別為L 5、L 35、L 2、L 0、0· 75、0· 5、0· 35和 0. 2 μ 1 ;1~8為等量SAV RNA模板；9~16 :為等量PSV RNA模板；17~24 :為等量PEDV R NA模板；
[0022] 圖3是多重RT-PCR不同退火溫度的電泳圖；M. DNA標準DL2000 ; 1~8的Tm值分 別為 53. 0、53· 8、54· 5、55· 0、55· 5、56· 0、56· 8、57. 5°C 8 個梯度；
[0023] 圖4是不同混合模板的多重RT-PCR的電泳圖；M. DNA標準D L2000 ;1.為PEDV、 PSV 和 SAV 混合 RNA 模板；2 ~6 :為 PEDV-TGEV-GARV 三聯弱毒疫苗 RNA、PSV、SAV、CSFV、 PRRSV RNA 模板；7 ~10 :PCV2、PRV、PPV DNA 模板以及 H2O ;
[0024] 圖5是PEDV、PSV和SAV混合RNA模板不同濃度的電泳圖；M. DNA標準DL2000 ; 1~ 7 :PEDV、PSV 和 SAV 混合 RNA 模板稀釋度依次為 10°、101、102、103、104、10 5、106、107。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0026] 實驗材料
[0027] 病毒：豬瘟病毒（CSFV)和豬圓環病毒II型（PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、豬偽狂犬病毒（PRV)弱毒疫苗和豬薩佩羅病毒（PSV)、豬札幌病毒（SaV)由作者 實驗室保存，豬細小病毒（PPV)、豬流行性腹瀉病毒（PHW)、流行性腹瀉-豬傳染性胃腸 炎-豬A群輪狀病毒三聯弱毒株由浙江大學動物預防醫學實驗室提供。
[0028] 主要試劑及儀器：RNAiso Plus (Total RNA extraction reagent)(批號： v201301Da)、PrimeScriptTM One St印 RT-PCR Kit Ver. 2(批號：v201309Da、AK3402)、 TaKaRa Ex Taq Hot Start (批號：NA501CA)和 DL2000DNA Marker 購自大連寶生物工程有 限公司；氯仿、異丙醇、冰乙醇購自上海化學試劑有限公司。S1000TM Ther mal Cycler PCR 儀、Bio-RAD Gel DocTM XR+紫外凝膠成像分析系統和核酸電泳儀為美國Bio-RAD公司產 品。
[0029] 實施例1 RT-PCR反應體系的建立
[0030] 1)根據GenBank收錄的PEDV序列（cv777) Sl基因