修飾的TGF-β寡核苷酸的制作方法
【專利說明】修飾的TGF-β寡核苷酸
[0001] 本發明涉及由TGF-β 2核酸序列的選定區域或TGF-β 1或TGF-β 3核酸序列的 選定區域的10-20個核苷酸組成的寡核苷酸，其包含修飾的核苷酸，如LNA、ENA、聚環氧烷、 2' -氟、2' -0-甲氧基和/或2' -0-甲基修飾的核苷酸。 技術背景
[0002] 轉化生長因子MTGF-β)是一種在大多數細胞中控制增殖、細胞分化和其他功 能的蛋白質。它是一種類型的細胞因子，其在免疫、癌癥、心臟病、糖尿病、馬凡綜合征、洛伊 斯-迪茨綜合征、帕金森病和AIDS等中起作用。
[0003] TGF-β是一種分泌的蛋白，其以至少三種同種型的形式存在（TGF-β 1、TGF-β 2 和TGF-β 3)，由不同基因編碼，但共有強序列和結構同源性。TGF-β在正常上皮細胞和 癌發生的早期以抗增殖因子的形式起作用。然而，在腫瘤發展的晚期，TGF-β通過包括 誘導上皮至間質瘤轉變（EMT)的機制促進腫瘤，該轉變是一種被認為參與腫瘤進展、侵染 和轉移的過程（參見"Glycoproteomic analysis of two mouse mammary cell lines during transforming growth factor (TGF)-beta induced epithelial to mesenchymal transiti〇n(轉化生長因子（TGF)-P誘導的上皮至間質瘤轉變期間兩種小鼠乳腺細胞系 的糖蛋白質組學分析）" 7th space, com. 2009-01-08.恢復：2009-01-29)。
[0004] 在正常（上皮）細胞中，TGF- β在GI期停止細胞周期（并停止細胞增殖）、誘導 分化或促進凋亡。當細胞轉化為癌細胞時，TGF-β不再抑制細胞增殖，其通常是信號轉導 途徑中突變的結果，且癌細胞增殖。間質成纖維細胞的增殖也由TGF-β誘導。兩種細胞都 提高其TGF-β生產。該TGF-β作用于周圍間質細胞、免疫細胞、內皮、平滑肌細胞和腫瘤 微環境（參見 Pickupet 等，"The roles of TGF6 in the tumour microenvironment (腫 瘤微環境中 TGF6 的作用）"，Nature Reviews Cancer (2013)，13:788-799)。因而，其促進 血管生成，并通過抑制增殖和免疫細胞的激活導致免疫抑制。
[0005] TGF- β 1缺陷型小鼠死于心、肺和胃炎癥，暗示TGF- β在抑制炎性細胞激活和增 殖方面至關重要。Smad3是TGF-β依賴性下游信號通路中的關鍵元件之一。Smad3缺陷 型小鼠由于T細胞激活和粘膜免疫受損而發生慢性粘膜感染，暗示TGF-β在這些過程中 的關鍵作用。對于癌癥，某些癌細胞產生和分泌的TGF-β抑制浸潤性免疫細胞的活性， 從而幫助腫瘤逃脫宿主免疫監控。該免疫抑制作用可以是另一種重要機制，TGF-β通過 該機制刺激晚期腫瘤的生長（參加 Blobe GC等，2000年5月，"Role of transforming growth factor beta in human disease(人疾病中轉化生長因子 β 的作用）"，N.Engl. J. Med. 342 (18)，1350-1358)。TGF-β還將正常情況下使用炎性（免疫）反應攻擊癌癥的效 應T細胞轉化為關閉炎性反應的調節性（抑制）T細胞。
[0006] 此外，TGF-β是胞外基質產生和沉積的最有力調控因子之一。其通過兩種主要 機制刺激胞外基質的產生并影響其粘附性質。首先，TGF-β刺激成纖維細胞和其他細胞 產生胞外基質蛋白和細胞粘附蛋白，包括膠原、纖連蛋白和整聯蛋白。其次，TGF-β減少 降解胞外基質的酶（包括膠原酶、肝素酶和間質溶解素）的產生，并增加抑制降解胞外基 質的酶的蛋白質（1型纖溶酶原激活物抑制劑和金屬蛋白酶的組織抑制劑）的產生。這些 變化的凈作用是增加胞外基質蛋白的產生并以細胞特異性方式提高或降低細胞的粘附性 質。TGF-β產生在許多癌細胞中增加，其通過提高細胞的蛋白水解活性和促進其結合細胞 粘連分子來提高細胞的侵染性（參見Blobe GC等，2000年5月，〃Role of transforming growth factor beta in human disease(人疾病中轉化生長因子 β 的作用）〃，N.Engl. J. Med. 342(18)，1350-1358)。
[0007] 因此，能夠分別影響TGF-β表達和活性的治療劑至關重要，特別是用于預防和/ 或治療TGF-β相關疾病時。例如，EP 1008649和EP 0695354公開了與TGF-βΙ和/或 TGF-β 2的mRNA雜交的寡核苷酸，且其適用于制造例如用于預防和/或治療癌癥的藥物組 合物。這些寡核苷酸無一包含諸如LNA、ENA等的修飾。
[0008] 例如，WO 2003/85110、WO 2005/061710 和 WO 2008/138904 涉及可用于治療癌癥 的包含核苷酸修飾的寡核苷酸，其分別涉及抑制HIF-1A、Bcl-2和HER3。
[0009] 寡核苷酸選擇的標準主要是寡核苷酸的長度、GC百分比、形成發夾結構的趨勢、二 聚化和解鏈溫度（Tm)。通常，優選高Tm(解鏈溫度）。此外，這些寡核苷酸必須特異性針對 靶mRNA且不與非靶mRNA雜交以降低潛在的脫靶作用。
[0010] 因此，科學和醫療上非常需要降低或抑制TGF-β表達和/或活性的治療劑。具體 而言，持續需要諸如反義寡核苷酸的寡核苷酸，其與TGF- β UTGF- β 2和/或TGF- β 3特異 性相互作用并因此降低或抑制其表達，或者特異性抑制TGF-β 1和TGF-β 2、或TGF-β 1和 TGF- β 3、或TGF- β 2和TGF- β 3的表達，而不導致任何（嚴重的）副作用。
【發明內容】
[0011] 本發明涉及的寡核苷酸由SEQ ID Ν0.1的TGF-02核酸序列（參見圖2)或 SEQ ID NO. 335 的 TGF- β 1 核酸序列（參見圖 12)或 SEQ ID NO. 336 的 TGF- β 3 核酸 序列（參見圖25)的10-20個（優選12-18個）核苷酸組成，該寡核苷酸中的一個或 多個核苷酸是經修飾的。本發明的一些寡核苷酸對應于TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3， 或 TGF-β 1 和 TGF-β 2 或 TGF-β 1 和 TGF-β 3 或 TGF-β 2 和 TGF-β 3。優選的寡核苷 酸包含 SEQ ID NO. 2-149 (TGF-β 2)之一、SEQ ID No. 150-334 (TGF-β?)之一或 SEQ ID No. 337-402 (TGF- β 3)之一或由其組成，其示于表1。
[0012] 具體而言，本發明的寡核苷酸包含SEQ ID NO. 1的第1380-1510位核酸區域的 10-20個（優選12-18個）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經修 飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β 2表達和活性方面高度有效。優選的寡核 苷酸包含或由以下序列組成：SEQ ID NO. 2 (如 ASPH36: GACCAGATGCAGGA)、SEQ ID NO. 3 (如 ASPH80:GCGACCGTGACCAGAT)、SEQIDN0·4(如ASPH98:GCGCGACCGTGACC)、SEQIDN0·5(如 ASPH111:AGCGCGACCGTGA)，或 SEQ ID Ν0·6(如 ASPH121 或 ASPH153:GACCGTGACCAGAT)、 SEQ ID NO·7(如 ASPH15:CTGCCCGCGGAT)、SEQ ID NO·8(如 ASPH17:TCTGCCCGCGGAT)、 SEQ ID Ν0·9(如 ASPH26 或 ASPH27:GGATCTGCCCGCGGA)、SEQ ID NO. 10(如 ASPH37:CTTGCTCAGGATCTGCC)、SEQ ID NO. 11(如 ASPH52 或 53:GCTCAGGATCTGCCCGCGGA)、 SEQIDN0·12(如ASPH112:GGATCGCCTCGAT)、SEQIDN0·13(如ASPH119:CCGCGGATCGCC)， 或 SEQ ID NO. 31(如 ASPH30:CGATCCTCTTGCGCAT)。
[0013] 在另一個實施方式中，本發明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的第2740-2810位核酸區域的10-20個（優選12-18個）核苷酸或由其組成，該 寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β 2 表達和活性方面高度有效。優選的寡核苷酸包含或由以下序列組成：SEQ ID NO. 57(如 ASPH65:TCTGAACTAGTACCGCC)、SEQ ID Ν0·73(如 ASPH82:AACTAGTACCGCCTTT)，或 SEQ ID NO. 103(如 ASPHl15:CTAGTACCGCCTT)。
[0014] 在另一個實施方式中，本發明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的 TGF-β 2核酸序列的第1660-1680位核酸區域的10-20個（優選12-18個）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經修飾的。這些寡核苷酸分別在降低 和抑制TGF-β 1和/或TGF-β 2表達和活性方面高度有效。優選的寡核苷酸包含或 由以下序列組成：SEQ ID NO. 14(如 ASHPOl 或 ASPH02:ACCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQ ID NO. 15(如 ASPH03 或 ASPH04:CCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQ ID NO. 16(如 ASPH05、ASPH06 或 ASPH07:CTCCTTGGCGTAGTA)，或 SEQ ID NO. 17(如 ASPH08:TCCTTGGCGTAGTA)。
[0015] 在另一個實施方式中，本發明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的第2390-2410位核酸區域的10-20個（優選12-18個，最優選13個）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑 制TGF-β UTGF-β 2和/或TGF-β 3表達和活性方面高度有效。優選的寡核苷酸包含或由 以下序列組成：SEQ ID NO. 18 (如 ASPH9 或 ASPH10:CAGAAGTTGGCAT)。
[0016] 在另一個實施方式中，本發明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的10-20個（優選12-18個）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核 苷酸是經修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF- β 1、TGF- β 2和/或TGF- β 3 (且 最優選TGF-β 2)表達和活性方面高度有效。優選的寡核苷酸包含或由以下序列之一組成： SEQ ID NO. 19-56、58-72、74-102、104-138(例如 ASHPl 1-ASPH14、ASPH16、ASPH18-ASPH25、 ASPH28-ASPH35、ASPH38-ASPH51、ASPH60-64、ASPH66-ASPH79、ASPH81、ASPH83-ASPH97、 ASPH99-ASPH110、ASPH113、ASPH114、ASPH116-118、ASPH120、ASPH122-ASPH152、 ASPH154-ASPH183,或 T-LNA(SEQ ID N0:144))。
[0017] 本發明中優選的寡核苷酸分別是ASPHO1、ASPH03、ASPH05、ASPHl7、ASPH22、 ASPH26、ASPH27、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH45、ASPH47、ASPH48、ASPH65、ASPH69、ASPH71、 ASPH80、ASPH82、ASPH98、ASPH105、ASPH115、ASPH190、ASPH191、ASPH192 和 ASPH193。
[0018] 本發明中其他優選的寡核苷酸是表1所示的ASPH1000至ASPH1132,其優選抑制 TGFf3 I mRNA的表達和/或活性。該組中優選的寡核苷酸分別是例如ASPH1047、ASPH1051、 ASPH1059、ASPHl 106、ASPHl 139、ASPHl 150、ASPHl 162、ASPHl 163、ASPHl 175、ASPHl 178 和 ASPHl181〇
[0019] 在替代性實施方式中，寡核苷酸優選抑制TGF0 3 mRNA的表達和/或活性。這 類寡核苷酸分別是例如 ASPH2000、ASPH2001、ASPH2002、ASPH2003、ASPH2004、ASPH2005、 ASPH2006、ASPH2007、ASPH2008、ASPH2009、ASPH2010、ASPH2011、ASPH2012、ASPH2013、 ASPH2014、ASPH2015、ASPH2016、ASPH2017、ASPH2018、ASPH2019、ASPH2020、ASPH2021、 ASPH2022、ASPH2023、ASPH2024、ASPH2025、ASPH2026、ASPH2027、ASPH2028、ASPH2029、 ASPH2030、ASPH2031、ASPH2032、ASPH2033、ASPH2034、ASPH2035、ASPH2036、ASPH2037、 ASPH2038、ASPH2039、ASPH2040、ASPH2041、ASPH2042、ASPH2043、ASPH2044、ASPH2045、 ASPH2046、ASPH2047、ASPH2048、ASPH2049、ASPH2050、ASPH2051、ASPH2052、ASPH2053、 ASPH2054、ASPH2055、ASPH2056、ASPH2057、ASPH2058、ASPH2059、ASPH2060、ASPH2061、 ASPH2062、ASPH2063、ASPH2064、ASPH2065 和 ASPH2066。
[0020] 本發明的寡核苷酸顯示對TGF- β 1、TGF- β 2或TGF- β 3,或TGF- β 1和TGF- β 2 的意料之外的強且特異性抑制。或者，本發明的寡核苷酸顯示對TGF-β 1和TGF-β 3或 TGF- β 1和TGF- β 2或TGF- β 2和TGF- β 3,并在另一情況下顯示對TGF- β I、TGF- β 2和 TGF-β 3的強且特異性抑制。
[0021] 本發明的核苷酸中的一個或多個核苷酸的修飾選自LNA、ΕΝΑ、聚環氧烷（如三甘 醇（TEG))、2'_氟、2'-0-甲氧基和2'-0-甲基。這些修飾優選位于寡核苷酸的5'和/或 3'端。包含這類修飾的核苷酸的寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。
[0022] 修飾的核苷酸是排列為例如一列（彼此直接緊鄰）或不同的模式（此時一個或多 個未修飾的核苷酸在一個修飾的核苷酸后）。例如，寡核苷酸以一個或多個修飾的核苷酸起 始，隨后是一個或多個（如一個、兩個、三個或四個）未修飾的或未鎖定的（unlocked)核苷 酸，隨后再是一個或多個修飾的核苷酸。在一個實施方式中，該寡核苷酸的兩端都包含相同 模式的修飾的和未修飾的或未鎖定的核苷酸。在另一個實施方式中，3'和5'端的修飾模式 不同，包括一端不包含修飾的核苷酸。優選地，修飾的寡核苷酸包含連續8或9個未鎖定的 核苷酸。
[0023] 或者，該寡核苷酸中任何其他位置的核苷酸，或者該寡核苷酸的5'和/或3' 端處和該寡核苷酸中的任何其他位置的至少一個核苷酸是經修飾的。例如，ASPH1071、 ASPHl100、ASPHl109、ASPH 1110、ASPH1111、ASPH1115、ASPHl126、ASPHl127 和 ASPHl128 屬 于一組TGF-β寡核苷酸，例如TGF-β 1寡核苷酸，其包含處于不同模式（例如由未鎖定的 核苷酸隔開彼此）中的修飾的核苷酸（如LNA、ENA等）。這些寡核苷酸包含一種類型的修 飾，或一種或多種不同的修飾。任選地，寡核苷酸的兩個連續核苷酸（修飾或未修飾的）之 間的至少一個磷酸連接是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。在優選的實施方式中，本發明的寡核 苷酸是硫代磷酸酯。
[0024] 此外，本發明涉及TGF-β反義寡核苷酸，其與超過一種TGF-β同種型相互作用并 抑制其表達，即使在寡核苷酸與TGF- β I、TGF- β 2和/或TGF- β 3序列非100 %互補的情況 下也是如此。這類反義寡核苷酸分別是例如ASPH1024、ASPH1096、ASPH1131和ASPH1132。這 些寡核苷酸優選與不同物種（如人和小鼠）的TGF-β序列相互作用，例如分別是ASPH1131 和 ASPHl132。
[0025] 不同實施方式的所有寡核苷酸均用于預防和/或治療以下疾病的方法：惡性或良 性腫瘤、免疫疾病、纖維化（如特發性肺纖維化、腎臟纖維化、腎纖維化）、硬化（肝硬化）、 硬皮病或相關皮膚疾病、眼疾病（如青光眼或后囊膜混濁（PCO) )、CNS疾病、脫發等。
【附圖說明】
[0026] 圖1顯示核苷酸修飾的示例。
[0027] 圖 2 顯示人 TGF- β 2 mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003238· 3)。
[0028] 圖3a)至3c)顯示人Α172神經膠質瘤細胞中TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA表達的抑 制。以IOnM的劑量使用不同的修飾的寡核苷酸轉染A172細胞（在轉染試劑存在的情況 下），并在轉染后24小時測量TGF- β 1 (白色柱）和TGF- β 2 (黑色柱）mRNA表達的抑制。 圖3&)是以下修飾的寡核苷酸的結果45?!101、45?!102、45?!103、45?!104、45?!105、45?!106、 ASPH07、ASPH08、ASPH09、ASPH10、ASPH11、ASPH12、ASPH13、ASPH14、ASPH15、ASPH16、ASPH17、 ASPH18、ASPH19、ASPH20、ASPH21、ASPH22、ASPH24、ASPH25、ASPH26、ASPH27、ASPH29、ASPH30、 ASPH31、ASPH32、ASPH33、ASPH34、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH38、ASPH39、ASPH40、ASPH41、 ASPH