SPH1102、ASPH1103、ASPH1104、 ASPH1105、ASPH1106、ASPH1107、ASPH1108、ASPH1109、ASPH1110、ASPH1111、ASPH1112、 ASPH1113、ASPH114、ASPH1115、ASPH1116、ASPH1117、ASPH1118、ASPH1119、ASPH1120、 ASPH1121、ASPH1122、ASPH1123、ASPH1124、ASPH1125、ASPH1126、ASPH1127、ASPH1128、 ASPH1129、ASPH1130、ASPH1131 和 ASPH1132。實驗描述于實施例 16。
[0042] 圖 18a 顯示人 Panc-I 和 RenCa 細胞中 TGF- β UTGF- β 2 和 TGF- β 3 mRNA 表達的 抑制。在不存在任何轉染試劑的情況下，以3. 3 μΜ的劑量使用不同的修飾的寡核苷酸轉染 細胞（自主轉染或無協助轉染或自主遞送），并在轉染后72小時測量TGF- β 1 (黑色柱）、 TGF-β 2 (白色柱）和TGF-β 3 (條紋柱）mRNA表達的抑制。圖18a是以下修飾的寡核苷酸的 結果：ASPH1063、ASPH1064、ASPH1065、ASPH1066、ASPH1067、ASPH1068、ASPH1069、ASPH1070、 ASPH1071、ASPH1072、ASPH1073、ASPH1074、ASPH1075、ASPH1076、ASPH1077、ASPH1078、 ASPH1079、ASPH1080、ASPH1081、ASPH1082、ASPH1083、ASPH1084、ASPH1085、ASPH1086、 ASPH1087、ASPH1088、ASPH1089、ASPH1090、ASPH1091、ASPH1092、ASPH1093、ASPH1094、 ASPH1095、ASPH1097、ASPH1098、ASPH1099、ASPH1100、ASPH1101、ASPH1102、ASPH1103、 ASPH1104、ASPH1105、ASPH1106、ASPH1107、ASPH1108、ASPH1109、ASPH1110、ASPH1111、 ASPH1112、ASPH1113、ASPH114、ASPH1115、ASPH1116、ASPH1117、ASPH1118、ASPH1119、 ASPH1120、ASPH1121、ASPH1122、ASPH1123、ASPH1124、ASPH1125、ASPH1126、ASPH1127、 ASPH1128、ASPH1129、ASPH1130、ASPH1131 和 ASPH1132。圖 18b 顯示 RenCa 細胞中這些寡 核苷酸的抑制效果。
[0043] 圖 19 顯示 ASPH1024 和 ASPH1096 與人 TGF-β l、TGF-0 2 和 TGF-0 3 mRNA 序列的 序列比對。兩種寡核苷酸都與人TGF-M序列100%同源。ASPH1024與人TGF-β 2序列之 間存在三個錯配（圖19a)且與人TGF-β 3序列之間存在兩個錯配（圖19b)。ASPH1096與 人TGF-β 2序列之間存在一個錯配（圖19a)且與人TGF-β 3序列之間存在一個錯配（圖 19b)。兩種寡核苷酸都顯示對不同人TGF-β同種型（TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3)的抑 制。例如，ASPH1024抑制TGF-β 1和TGF-β 2的表達和活性（參見圖16)且ASPH1096抑 制TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3的表達和活性（例如參見圖17)。與人TGF-β 1、TGF-β 2 和TGF- β 3序列100%同源的ASPH009用作對照。
[0044] 圖 20 顯示ASPHl 131 和 ASPHl 132 與人TGF-β UTGF-β 2 和 TGF-β 3 mRNA序列的序 列比對。兩種寡核苷酸都與人TGF-β 1和TGF-0 3序列100%同源。ASPH1131和ASPH1132 各自與人TGF-β 2序列之間存在一個錯配。兩種寡核苷酸都強力抑制全部三種人同種型的 表達，例如參見圖17。
[0045] 圖 21 顯示ASPHl 131 和 ASPHl 132 與鼠 TGF-β UTGF-β 2 和 TGF-β 3 mRNA序列的序 列比對。兩種寡核苷酸都與鼠 TGF-β 1和TGF-β 3序列100%同源。ASPH1131和ASPH1132 各自與鼠 TGF-β 2序列之間存在兩個錯配。ASPHl 131強力抑制鼠 TGF-β 2和TGF-β 3,而 ASPH1132非常強力地抑制所有鼠 TGF-β同種型，例如參見圖18b。
[0046] 圖22顯示攜帶皮下人胰腺癌Panc-I的小鼠的腎中TGF-β 2 mRNA的表達。在所 示治療方案后使用1、3、10和30mg/kg的ASPH47治療小鼠，持續5天：QlDxl-d6 (單次SC 注射，5天后終止），QlDx5-d6 (每天SC注射持續5天，24小時后終止）以及QlDx5-dlO (每 天SC注射持續5天，5天后終止）。通過bDNA試驗檢測TGF- β 2表達并標準化至GAPDH。 TGF- β 2與GAPDH mRNA比例的數據顯示于箱線圖中，其中顯示了中值、最小值和最大值（數 據表示為η = 10,例外是載劑和3mg/kg QlDxld6組η = 9)。
[0047] 圖23顯示攜帶人胰腺癌Panc-I腫瘤的小鼠的腎中TGF-β 2 mRNA的表達。使用 所示治療劑量通過皮下注射多種寡核苷酸對小鼠連續治療5天：每天注射1、5、15或50mg/ kg寡核苷酸，連續注射5天。通過bDNA試驗檢測TGF- β 2mRNA表達并標準化至GAPDH。 TGF- β 2與GAPDH mRNA比例的數據顯示于箱線圖中，其中顯示了中值、最小值和最大值（數 據表示為η = 5)。
[0048] 圖24顯示皮下人腎細胞癌786-0腫瘤中TGF-β 2 mRNA的表達。通過每天注射 50mg/kg寡核苷酸對小鼠連續治療5天。通過bDNA檢測TGF- β 2和GAPDH mRNA表達。 TGF- β 2與GAPDH mRNA比例的數據顯示于箱線圖中，其中顯示了中值、最小值和最大值（數 據表示為η = 10,例外是ASPH71組η = 9)。
[0049] 圖 25 顯示人 TGF- β 3 mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003239· 2)。
[0050] 圖26顯示本發明的寡核苷酸對TGF-β 1和TGF-I3 2蛋白質表達的抑制作用。 使用 20、6. 67、2. 22、0. 74、0. 25、0. 08 或 0. 009 μ M 的修飾的寡核苷酸 ASPH47(圖 26a)、 ASPH1047(圖 26b)、ASPH1106(圖 26c)、ASPH1132(圖 26d)或 ASPH47 與 ASPH1047 聯用 (圖 26e)轉染 Panc-I 細胞。陰性對照是濃度為 40、13. 33、4· 44、L 48、0· 49、0· 16、0· 05 或 0. 02 μ M的SEQ ID No. 145的錯義寡核苷酸（scrLNA)(圖26f)。通過ELISA測定細胞上 清液中的TGF-β 1 (菱形）和TGF-β 2蛋白質（方形）水平。
[0051] 圖27顯示本發明的寡核苷酸對TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3表達的抑制作用。 在不存在轉染試劑的條件下使用3. 3 μ M不同的TGF-β特異性寡核苷酸轉染Panc-I細胞 (圖27a)或RenCa細胞（圖27b)。在轉染后72小時測定TGF- β 1 (黑色柱）、TGF- β 2 (白 色柱）和TGF- β 3 (條紋柱）mRNA的表達。
[0052] 圖28顯示本發明的寡核苷酸對TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3表達的抑制作用。 在存在轉染試劑的條件下使用IOnM不同的TGF-β特異性寡核苷酸轉染Α172神經膠質瘤 細胞。在轉染后24小時測定TGF- β 1 (黑色柱）、TGF- β 2 (白色柱）和TGF- β 3 (條紋柱） mRNA的表達。
[0053] 圖29a和29b顯示向Balb/c小鼠單次皮下推注給予50mg/kg的ASPH_0047后 TGF-β 2 mRNA的時間依賴性血漿（29a)和腎（29b)濃度（PK曲線；值以μ g/mL或μ g/gr 表示）和腎中TGF-β 2 mRNA (PD曲線）下調的比較分析。
[0054] 圖30顯示皮下重復給予ASPH_0047或對照寡核苷酸后免疫缺陷小鼠中已建立的 皮下腫瘤（圖30A-D)或腎（圖30E-F)中TGF-β 2 mRNA的下調。通過bDNA檢測TGF-β 2 和GAPDH mRNA表達。結果表示為TGF-f3 2/GAPDH mRNA比例，且各單獨測試的樣品表示為 顯示中值的線。
[0055] 圖31顯示在原位和靜脈內小鼠 Renca腎癌模型中的肺轉移癌上使用 ASPH_0047 (選擇性TGF- β 2反義寡核苷酸）系統性治療Balb/c小鼠的作用。通過轉移癌 的數目或基于肺重量來測定肺轉移癌的水平。結果顯示于箱線圖中，其中顯示了中值、上四 分位數、下四分位數以及90和10百分位數。
[0056] 圖32顯示在不存在轉染試劑的情況下（自主轉染或自主遞送），使用3. 3μ M 的所示寡核苷酸治療人Panc-I胰腺癌細胞。在轉染后72小時測定TGF-β 1 (黑色柱）、 TGF- β 2 (白色柱）和TGF- β 3 (條紋柱）mRNA的表達。
[0057] 圖33顯示在原位小鼠4T1乳腺癌模型中的肺轉移癌上使用ASPH_0047系統性治 療Balb/c小鼠的效果。各單個動物的數據顯示為以粗黑線表示的中值。
[0058] 發明詳沐
[0059] 本發明涉及寡核苷酸，特別是反義寡核苷酸，其包含至少一個修飾的核苷酸并 適用于與TGF-PmRNA相互作用。這些寡核苷酸包含或由以下序列組成：SEQ ID NO. 1的 TGF- β 2 核酸或 SEQ ID NO. 335 的 TGF- β 1 核酸或 SEQ ID NO. 336 的 TGF- β 3 核酸的 10-20 個（更優選12-18個）核苷酸。最優選地，該寡核苷酸包含或由12、13、14、15、16、17或18 個核苷酸組成。這些寡核苷酸優選選自SEQ ID NO. 1的第1380-1510號（優選第1380-1450 號和/或第1480-1510號）、第1660-1680號或第2390-2410號核酸區域。該寡核苷酸是單 鏈或雙鏈RNA或DNA，包括siRNA、微小RNA、適體或鏡像體（spiegelmer)。優選地，該寡核 苷酸是反義寡核苷酸。
[0060] 核苷酸形成寡核苷酸的結構模塊，且例如由以下物質組成：核堿基（含氮堿基，如 嘌呤或嘧啶）、五碳糖（如核糖、2-脫氧核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄 糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖或這些糖的穩定化的修飾體）和一個或多個磷 酸基團。修飾的磷酸基團的示例是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。各種核苷酸的化合物都是可 修飾的，且是天然產生的或非天然產生的。后者是，例如，鎖核酸（LNA)、2'-0, 4'-C-乙烯橋 接核酸（ENA)、聚環氧烷（如三甘醇（TEG))、2' -氟、2' -0-甲氧基和2' -0-甲基修飾的核苷 酸，參見例如 Freier 和 Altmann (Nucl. Acid Res.，1997, 25, 4429-4443)和 Uhlmann (Curr. Opinion in Drug&Development(2000,3(2):293_213))，其不于圖 1〇
[0061] LNA是一種修飾的RNA核苷酸，其中，核糖部分被連接2'氧和4'碳的額外橋修飾 (2'-4'核糖核苷）。該橋將核糖"鎖定"為3'-內（北）構象，其通常發現于A型雙鏈體 中。LNA核苷和核苷酸分別包含例如硫代-LNA、氧基-LNA或氨基-LNA的形式（以a -D-或 β -L-構型），且與寡核苷酸中DNA或RNA殘基分別是可混合和可合并的。
[0062] 本發明的寡核苷酸（即修飾的寡核苷酸）在寡核苷酸的5'和/或3'端包含至少 一個修飾的核苷酸（優選LNA和/或ΕΝΑ)。在優選的實施方式中，該寡核苷酸包含位于5' 端的1、2、3或4個LNA或ENA和位于3'端的1、2、3或4個LNA或ΕΝΑ。在另一個優選的實 施方式中，該寡核苷酸包含位于5'端或3'端的1、2、3或4個LNA或ΕΝΑ，以及位于3'或 5'端的聚環氧烷（如TEG)。這些修飾的寡核苷酸分別對于TGF-β表達和修飾顯示顯著增 加的抑制，其導致以下疾病預防和/或治療的改善：惡性或良性腫瘤、免疫疾病、纖維化（如 特發性肺纖維化、腎臟纖維化、腎纖維化）、硬化（肝硬化）、硬皮病或相關皮膚疾病、眼疾 病（如青光眼或后囊膜混濁（PCO))、CNS疾病、脫發等。本發明的寡核苷酸通過以下方式靶 向 TGF- β 連接的疾病：與 TGF- β mRNA (優選 TGF- β I、TGF- β 2 或 TGF- β 3)或者 TGF- β 1、 TGF- β 2 和 / 或 TGF- β 3 mRNA (即 TGF- β 1 和 TGF- β 2,或 TGF- β 1 和 TGF- β 3,或 TGF- β 2 和TGF- β 3,或TGF- β I、TGF- β 2和TGF- β 3 mRNA)雜交或任何其他直接或間接對TGF- β 系統的作用。
[0063] 優選合并兩種或更多種寡核苷酸，其中，至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 1 且至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 2,或至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 1且至 少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 3,或至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 2且至少一 種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 3,或至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 1且至少一種寡 核苷酸特異性抑制TGF-β 2且至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 3。
[0064] 在另一個實施方式中，一種寡核苷酸抑制兩種TGF-β同種型，例如TGF-β 1和 TGF- β 2、TGF- β 2 和 TGF- β 3 或 TGF- β 1 和 TGF- β 3。
[0065] 抑制全部三種同種型（TGF- β UTGF- β 2和TGF- β 3)表達的寡核苷酸被定義為泛 特異性寡核苷酸。
[0066] 在另一個實施方式中，合并三種或更多種寡核苷酸，其中，至少一種寡核苷酸特 異性抑制TGF-β 1，另一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β 2,且另一種寡核苷酸特異性抑制 TGF- β 3,且任選地一種或多種其他寡核苷酸抑制TGF- β 1、TGF- β 2或TGF- β 3。
[0067] 本發明的寡核苷酸的IC5。范圍是，例如，0. 1至20 μ Μ，優選0.2至15 μ Μ，更優 選0. 4至10 μ M，且甚至更優選〇. 5至5 μ M。
[0068] 本發明還涉及一種藥物組合物，其包含本發明的寡核苷酸作為活性成分。該藥物 組合物包含至少一種本發明的寡核苷酸且任選還包含反義化合物、抗體、化療化合物、抗炎 化合物、抗病毒化合物和/或免疫調節化合物。藥學上可接受的結合劑和佐劑或運載體任 選包含部分藥物組合物。
[0069] 在一個實施方式中，寡核苷酸和藥物組合物分別配制為膠囊劑、片劑和丸劑等形 式的劑量單位，其分別含有例如以下化合物：微晶纖維素、膠或明膠作為粘合劑；淀粉或乳 糖作為賦形劑；硬脂酸酯作為潤滑劑，多種甜味劑或調味劑。對于膠囊劑，該劑量單位可含 有液體運載體如脂肪油。同樣地，糖或腸溶劑的包衣可以是劑量單位的一部分。
[0070] 該寡核苷酸和/或藥物組合物可通過不同途徑給予。這些給藥途徑包括但不限 于：電穿孔、表皮、壓印至皮膚（impression into skin)、動脈內、關節內、顏內、皮內、傷口 內、肌內、鼻內、眼內、鞘內、房內、腹膜內、前列腺內、肺內、椎管內、氣管內、瘤內、靜脈內、粘 膜內、放置于身體腔內、鼻吸入、口服、肺吸入（通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴 霧器）、皮下、真皮下、局部（包括眼科和至粘膜，包括陰道和直腸遞送）或透皮。
[0071] 對于胃腸道外、皮下、皮內或局部給藥，該寡核苷酸和/或藥物組合物包含例如無 菌稀釋劑、緩沖劑、毒性調節劑和抗菌劑。在優選的實施方式中，該寡核苷酸或藥物組合物 使用保護免于降解或立即清除出身體的運載體制備，包括具有受控釋放性質的植入物或微 膠囊。對于靜脈內給藥，優選的運載體是例如生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水。用于口服給藥 的寡核苷酸和/或包含這類寡核苷酸的藥物組合物包括例如粉末劑或顆粒劑、微粒、納米 微粒、水或非水介質中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、囊袋、片劑或小型片劑。用 于胃腸道外、鞘內、房內或囊泡內給藥的寡核苷酸和/或藥物組合物包含例如無菌水溶液， 其任選含有緩沖劑、稀釋劑和/或其他合適的添加劑（如透過增強劑、運載體化合物和/或 其他藥學上可接受的運載體或賦形劑）。
[0072] 藥學上可接受的運載體是例如液體或固體，且根據計劃的給藥方式選擇，從而在 與核酸和給定藥物組合物的其他組分合并時提供所需體積、持久性等。典型的藥學上可接 受的運載體包括但不限于：粘合劑（如預膠化玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基 纖維素等）；填充劑（如乳糖和其他糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙 烯酸酯或磷酸氫鈣等）；潤滑劑（如硬脂酸鎂、滑石、二氧化硅、膠體二氧化硅、硬脂酸、金屬 硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等）；崩解劑（如淀粉、羥乙 酸淀粉鈉等）或潤濕劑（如月桂醇硫酸鈉等）。用于口服給藥劑型的緩釋口服遞送系統和 /或腸溶包衣描述于美國專利號4, 704, 295 ;4, 556, 552 ;4, 309, 406 ;和4, 309, 404。在這些 短語下包括佐劑。
[0073] 除了用于人疾病預防和/或治療的方法外，本發明的寡核苷酸和/或藥物組合物 還可用于其他對象的預防和/或治療方法，包括獸醫動物、爬行類動物、鳥類動物、珍稀動 物和農場動物，包括哺乳動物、嚙齒類動物等。哺乳動物包括例如馬、狗、豬、貓或靈長類動 物（例如猴、黑猩猩或狐猴）。嚙齒類動物包括例如大鼠、兔、小鼠、松鼠或豚鼠。
[0074] 本發明的寡核苷酸或藥物組合物被用于預防和/或治療許多不同疾病的方法，這 些疾病優選是良性或惡性腫瘤、免疫疾病、支氣管哮喘、心臟病、纖維化（例如肝纖維化、特 發性肺纖維化、肝硬