一種從發酵液中提取他克莫司的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物化學領域。具體而言，本發明涉及一種從發酵液中提取他克莫司的方法，更尤其，本發明涉及一種結合使用陶瓷膜、納濾膜并結合使用有機溶劑將發酵液中的他克莫司以異常高的收率提取出來的方法。
【背景技術】
[0002]他克莫司(Tacrolimus)又名FK506,是從鏈霉菌屬(streptomycestsukubaensis)中分離出來的發酵產物，其化學結構屬于23元大環內酯類抗生素。為一種強力的新型免疫抑制劑，近年來已成為肝、腎移植的一線用藥，也在自身免疫性疾病中發揮著積極作用。
[0003]目前從發酵液中提取他克莫司的方法基本是(1)用板框壓濾機或離心機實現菌絲體和水相的分離，用有機溶劑浸泡菌絲體提取脂溶性目標組分。上述方法的缺點是部分游離在水相中的脂溶性目標組分在菌絲體和水相分離時隨水相進入廢水中；操作對環境不友好，有機溶劑耗用量大；因菌絲體中成分復雜，在有機溶劑提取過程中易造成大量乳化，進而影響收率和質量；板框的裝拆、濾餅出料和濾布的清洗都為手工操作，并且輔助時間長，勞動強度大，生產效率低，從而影響整個生產的進度，與環保要求的符合度較低。(2)用有機溶劑直接在發酵液中浸提他克莫司。上述方法的缺點是溶劑耗用量大，易乳化，質量和收率不穩定。
[0004]現代膜分離技術起源于20世紀60年代，是一種新型的流體分離單元操作技術。它以高分子分離膜為分離介質，以壓力差、濃度差、電位差等為傳質驅動力，將待分離流體中的不同物質按照分子量、顆粒或電荷的不同進行分離。由于膜分離技術具有高效節能等特點，自第一套工業化設備推向市場以來，得到了迅猛發展，目前已遍及幾乎所有工業領域。按照膜分離的不同原理，可以把膜分成過微濾膜、超濾膜、納濾膜、反滲透膜、透析膜、電滲析膜、滲透汽化膜以及氣體分離膜等不同種類。
[0005]陶瓷膜是微濾膜中的一種，主要由A1203，Zr 02，Ti 02和Si 02等無機材料制備的多孔膜，其孔徑為1 一 200nm。具有化學穩定性好，能耐酸、耐堿、耐有機溶劑；機械強度大，可反向沖洗；抗微生物能力強，耐高溫，孔徑分布窄，分離效率高等特點，在食品工業、生物工程、環境工程、化學工業、石油化工、治金工業等領域得到了廣泛的應用。
[0006]陶瓷膜過濾是溶有有效成分的浸提液不停的向透出側透出的過程，與傳統的將固液分離過濾模式不同，因而整個過濾過程都不需要添加助濾劑。
[0007]納濾膜是允許溶劑分子或某些低分子量溶質或低價離子透過的一種功能性的半透膜，它截留有機物的分子量大約為150 - 500左右，被用于去除地表水的有機物和色度，脫除地下水的硬度，部分去除溶解性鹽，濃縮果汁以及分離藥品中的有用物質等。
[0008]中國專利CN1297475公開了一種用陶瓷膜從發酵液中分離水溶性產物的方法；中國專利CN1699358公開了一種用陶瓷膜分離茶黃素的方法；中國專利CN1775729公開了一種用陶瓷膜提取高純的檸檬酸的方法；中國專利CN101565395公開了一種用陶瓷膜提取L-色氨酸的方法，上述專利都是用陶瓷膜來過濾分離水溶性的目標產物，目前還沒有發現用陶瓷膜來過濾收集脂溶性成分的專利和報道，更未發現用陶瓷膜和納濾膜結合分離他克莫司的專利和報道。
【發明內容】
[0009]本發明致力于提供一種更簡單有效、環保、成本低的用于從發酵液中以高收率提取他克莫司的方法，即使發酵液的質量很差。
[0010]用于從發酵液中提取他克莫司的本發明的方法包括:
a)用陶瓷膜濃縮發酵液，接著
b)向發酵液濃縮液中持續加入一種或數種選自醇、二醇、酮、酯類、羧酸類有機溶劑或上述溶劑與水的混合物并使用陶瓷膜浸提后得他克莫司浸提液，接著
c)用納濾膜濃縮他克莫司浸提液得他克莫司納濾濃縮液。
[0011]本發明本發明涉及一種從發酵液中提取他克莫司的方法，更尤其，本發明涉及一種結合使用陶瓷膜、納濾膜等設備，用有機溶劑將發酵液中的他克莫司以異常高的收率提取出來的方法。
[0012]總的來說，從發酵液中提取他克莫司的方法包括用陶瓷膜濃縮發酵液，向發酵液濃縮液中持續加入一種或數種選自醇、二醇、酮、酯類、羧酸類有機溶劑或上述溶劑與水的混合物并使用陶瓷膜浸提后得他克莫司浸提液，用納濾膜濃縮浸提液。
[0013]陶瓷膜濃縮過程中可向發酵液中加入水、表面活性劑、酸、堿、有機溶劑與水的混合物或者改變發酵液溫度以改變發酵液性質。
[0014]浸提溶劑可以選自醇，例如:甲醇、乙醇、異丙醇；二醇，例如:1，3_丙二醇；酮類，例如:乙醇；酯類，例如:乙酸乙酯、乙酸丁酯；羧酸類，例如:乙酸。
[0015]浸提用的溶劑可以直接應用一種或數種混合使用，也可以是一種或數種與水混合使用，其中水的比例是1%到70%。
[0016]在一個優選的實施方案中，浸提使用的有機溶劑是甲醇、乙醇、乙酸乙酯、鹽酸。
[0017]在一個更優選的實施方案中，浸提使用的有機溶劑是乙醇，浸提使用有機溶劑特點是含有約30%~60%的水。
[0018]根據優選的實施方案，步驟c)中使用的流出液可以套回至步驟b)中，作為浸提溶劑進行陶瓷膜浸提。從而降低成本，并具有環保的效果。
[0019]本發明測定他克莫司含量方法采用高效液相色譜法，下面的實施例將說明本發明優選的實施例，但沒有限制本發明的范圍的意思。
[0020]下面通過實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明的實施例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬于本發明要求保護的范圍。
[0021]系統檢測條件
1)色譜系統
色譜柱:Z0RBAX SB C8 150 X 3mm, 3.5 μ m 或者相當
流動相:乙腈-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸(35:4:61:0.01)
樣品溫度:2~10°C 流速:1.2ml/min 檢測波長:210 nm 進樣量:10 μ 1 柱溫:60°C
2)溶液配制
稀釋劑:乙腈(使用前必須用無水氯化鈣干燥脫水)
標準溶液:精密稱取他克莫司標準品適量，配制成濃度為1.0mg/ml的溶液。(例如:50mg — 50ml)
樣品溶液:精密稱取他克莫司樣品適量，配制成濃度為1.0mg/ml的溶液。(例如:50mg — 50ml)
進樣程序:
進空白(乙腈)，應無干擾峰；進含有異構體I和異構體II的樣品溶液(如樣品溶液中不含異構體I或異構體II，則可通過加水來降解)，記錄圖譜，色譜圖中他克莫司及異構體的出峰順序依次為異構體1、II和他克莫司峰，相對保留時間分別為0.5,0.7和1.0，異構體II與他克莫司峰之間的分離度應大于3.0，理論板數按他克莫司峰計算，應不低于1000。連續進樣標準溶液6次，RSD應不得超過2.0%。
[0022]計算:
根據標準溶液和樣品溶液的峰面積，按以下公式計算效價:
Rf=標準溶液主峰平均面積/標準溶液濃度(μ g/ml)
樣品效價=(樣品溶液峰面積/ Rf) X稀釋倍數實施例1
他克莫司發酵液38L，效價227 μ g/ml，色譜純度87.1%。含他克莫司8.6g。發酵液用布氏漏斗過濾至無明顯液滴流出，將濕濾餅放入40L70%乙醇中浸泡攪拌6小時以上，過濾、收集濾液，得濾液36.6L，效價為172 μ g/ml，色譜純度60.4%，含他克莫司6.26g，廢渣中殘留他克莫司0.9g，部分他克莫司倍破壞。該過程他克莫司提取收率為73%。
[0023]實施例2
他克莫司發酵液153L，效價234 μ g/ml，色譜純度86.6%，含他克莫司35.8g，用板框過濾他克莫司發酵液至無明顯液滴流出為止，拆開板框收集濾餅。將濾餅浸入150L70%的乙醇中，攪拌6小時以上。板框過濾，收集濾液，得浸提液143L，效價為176.5yg/ml，色譜純度60.7%，含他克莫司25.2g，廢渣中含他克莫司4.3g，該過程他克莫司提取收率為70.4%。
[0024]實施例3
他克莫司發酵液70L，效價246 μ g/ml，色譜純度86.9%。含他克莫司17.2g。將發酵液放入陶瓷膜處理罐中(陶瓷膜規格如下:PALL 1960型膜芯，19通道，通道孔徑d=6mm，膜孔徑D=50nm,膜芯長L=lm，過濾面積S=0.358m2,試驗機離心泵:H=36m, Q=10T/h, P=3Kw),開機過濾，陶瓷膜透出端透出35L水后得發酵液濃縮液35L，開始加水水洗發酵液，維持發酵液體積35±2L直至水洗透出體積達到35L。向發酵液濃縮液中加入33L乙醇，攪拌均勻后，開啟陶瓷膜過濾，在陶瓷膜透出側得他克莫司乙醇浸提液。當罐內配制好的料液體積少于30L時，持續向陶瓷膜處理罐中加入配制好的70%乙醇(或納濾透出液)來浸提。將浸提液轉移至納濾膜處理罐，開納濾膜(納濾膜規格如下:GE2540型膜芯，截留分子量500，膜過濾面積S=2.5m2,試驗機柱塞泵:Λ P=70bar, Q=ll.9L/min, P=2.2Kw)濃縮。納濾膜透出端為70%乙醇，套回至陶瓷膜浸提。用高效液相跟蹤浸提過程，當透出浸提液體積為維持體積的5倍時停止補加70%乙醇(或納濾透出液)，將料液濃縮至25L，停陶瓷膜過濾，剩余料液為廢渣進一步處理。將所有浸提液轉移至納濾膜處理罐濃縮，最后濃縮液體積為15L。經HPLC檢測，濃縮液效價為1043.5 μ g/ml，色譜純度67%，含他克莫司15.65g，整個過程他克莫司提取收率為91%。
[0025]實施例4
他克莫司發酵液70L，效價250 μ g/ml，色譜純度87.6%。含他克莫司17.5g。將發酵液放入陶瓷膜處理罐中(陶瓷膜規格如下:PALL 1960型膜芯，19通道，通道孔徑d=6mm，膜孔徑D=50nm,膜芯長L=lm，過濾面積S=0.358m2,試驗機離心泵:H=36m, Q=10T/h, P=3Kw),開機過濾，陶瓷膜透出端透出35L水后得發酵液濃縮液35L，開始加水水洗發酵液，維持發酵液體積35±2L直至水洗透出體積達到35L。向發酵液濃縮液中加入14L乙醇，攪拌均勻后，開啟陶瓷膜過濾，在陶瓷膜透出側得他克莫司乙醇浸提液。當罐內配制好的料液體積少于30L時，持續向陶瓷膜處理罐中加入配制好的50%乙醇(或納濾透出液)來浸提。將浸提液轉移至納濾膜處理罐，開納濾膜(納濾膜規格如下:GE2540型膜芯，截留分子量500，膜過濾面積S=2.5m2,試驗機柱塞泵:Λ P=70bar, Q=ll.9L/min, P=2.2Kw)濃縮。納濾膜透出端為50%乙醇，套回至陶瓷膜浸提。用高效液相跟蹤浸提過程，當透出浸提液體積為維持體積的5倍時停止補加50%乙醇(或納濾透出液)，將料液濃縮至27L，停陶瓷膜過濾，剩余料液為廢渣進一步處理。將所有浸提液轉移至納濾膜處理罐濃縮，最后濃縮液體積為15L。經HPLC檢測，濃縮液效價為1069.8 μ g/ml，色譜純度66%，含他克莫司16g，整個過程他克莫司提取收率為91.7%。
[0026]實施例5
他克莫司發酵液70L，效價250 μ g/ml，色譜純度87.6%。含他克莫司17.5