如SEQIDNO. 5 所示）
[0040] 5' -TGAAACCGGTGAGGTGGAA-3，
[0041] 外側引物ptB32 (如SEQIDΝ0· 6 所示）
[0042] 5' -AGCTGGCCTCAAAACCAAG-3'
[0043] 內側引物ptFIP2 (如SEQIDΝ0· 7 所示）：
[0044] 5, -TCTGGAGTCGCCAGAGCTGGttttttACGGATAGAGCCAGCGTAT-3，
[0045]內側引物ptBIP2 (如SEQIDNO. 8 所示）：
[0046] 5, -GGACGGAGTTGGGGTTGTACACaaaaaaTCATCCCAACACCTCGAACA-3'
[0047]2、不同引物組的擴增效率
[0048] 按照BST2. 0DNA聚合酶的使用說明進行，環等溫擴增方法的反應體系為：1yL DNA，引物ptFIPl和ptBIPl各 1. 6μM，引物ptF31 和ptB31 各 0· 2μM，dNTPO. 35μM，2. 5μL 10XBST2. 0DNA聚合酶緩沖液，(λ8Μ甜菜堿，L5μLMgS04(100mM)，1μLBST2. 0DNA聚合 酶，余量ddH20補足，共25μL。環等溫擴增方法的反應條件為：65°C反應60min。
[0049] 結果如圖1，兩組引物都能從桑尼短體線蟲的DNA中擴增出特異的條帶。
[0050] 實施例2LAMP反應的特異性檢測
[0051]1、為驗證本發明引物組和LAMP反應體系的有效性和特異性，我們同時使用了多 個不同種群的桑尼短體線蟲和其他非靶標的線蟲的DNA作為模板進行檢測，具體線蟲種類 如表1所示。
[0052] 表1實驗使用的線蟲種群及對應的可視化檢測結果
[0053]
[0054] 2、分別提取表1中各線蟲的DNA，分別利用引物組1、引物組2,按照實施例1的中 所述的LAMP反應條件進行LAMP擴增。
[0055] 3、結果如附圖2、附圖3和表1所示，圖2(引物組1)中，3、4、5、6、7、8號管發生顏 色變化，為陽性；圖3 (引物組2)中，2、3、4、6、7、8號管發生顏色變化，為陽性。
[0056] 結果表明，本發明所述的LAMP引物組中，引物組2不能檢測桑尼短體線蟲種群 Pt3,而且對來自廣東湛江的落選短體線蟲有非特異反應，只有引物組1能有效的檢測不同 種群的桑尼短體線蟲，并且對非靶標線蟲不會有非特異性的擴增，即不能夠擴增檢測到非 靶標線蟲，對桑尼短體線蟲的特異性非常好。
[0057] 同時，本發明所述的LAMP方法能有效的檢測到單條的靶標線蟲，具有非常好的靈 敏性，能夠滿足實際的檢測和定量工作需要。
[0058] 實施例3LAMP反應的可視化檢測及靈敏性檢測
[0059] 1、綜上所述，本發明建立的快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增方法如下：
[0060] PCR反應體系為：1yLDNA，引物PtFIPl/PtBIPl各 1. 6μΜ，引物PtF31/PtB31 各 0.2μM，dNTP0.35μM，2.5yL10XBST2.0DNA聚合酶緩沖液（BST2.0DNApolymerase buffer)，0· 8M甜菜堿，1· 5μLMgS04(100mM)，1μLBST2. 0DNA聚合酶（BST2.ODNA polymerase)，余量ddH20 補足，共 25μL〇
[0061] 反應條件：65°C反應60min。
[0062] 2、根據上述反應體系和優化后的反應條件進行LAMP反應，反應結束后，不僅能通 過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，還能夠通過添加SYBRGreenI染料或鈣黃綠素進行可視化檢 測，結果判斷方法更靈活、更方便。
[0063] 3、分別以不同濃度的桑尼短體線蟲線蟲DNA為模板，以上述反應體系和反應條件 進行LAMP反應，反應結束后，使用2 %瓊脂糖凝膠電泳對上述產物進行檢測。
[0064] 同時，在LAMP反應產物中加入lyL5000XSYBRGreenI染料（購自 ThermoFisherscientific公司，使用前加入滅菌水稀釋至5000X的濃度）混勾后觀察結 果，陽性產物呈現出由橘紅色變為熒光黃或熒光綠色的顏色變化（具體顏色的深淺由產物 的含量決定），說明驗證可視化結果的準確。
[0065] 可視化結果如附圖4所示，圖4中，除了CK組，其他組均發生顏色變化，為陽性，電 泳檢測與可視化的結果一致，也說明了本發明檢測方法結果的穩定性和可靠性。
[0066] 同時上述結果也說明了本發明所述的LAMP反應方法能檢測到0. 1條桑尼短體線 蟲的DNA模板，具有非常好的檢測靈敏性。
【主權項】
1. 一種快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增引物組，其特征在于，包括外側引物 ptF31/ptB31和內側引物ptFIPl/ptBIPl;引物ptF31的序列如SEQIDN0.1所示，引物 ptB31的序列如SEQIDNO. 2所示，引物ptFIPl的序列如SEQIDNO. 3所示，引物ptBIPl 的序列如SEQIDNO. 4所示。2. 權利要求1所述環等溫擴增引物組在檢測桑尼短體線蟲方面的應用。3. 權利要求1所述環等溫擴增引物組在制備檢測桑尼短體線蟲的試劑或試劑盒方面 的應用。4. 一種快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增方法，其特征在于，該方法是以樣品DNA 為模板，利用權利要求1所述外側引物對ptF31/ptB31和內側引物對ptFIPl/ptBIPl進 行環介導等溫擴增反應。5. 根據權利要求4所述環等溫擴增方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增反應結果 的判定方法為：將擴增產物進行凝膠電泳，如果出現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有 桑尼短體線蟲DNA，即為桑尼短體線蟲陽性； 或者向擴增產物中加入SYBRgreenI或鈣黃綠素，如果擴增產物由橘紅色變為淺綠 色，則判定樣品中含有桑尼短體線蟲DNA，即為桑尼短體線蟲陽性。6. 根據權利要求4所述環等溫擴增方法，其特征在于，所述環等溫擴增方法的反應體 系為：1yLDNA，引物ptFIPl和ptBIPl各 1. 6μΜ，引物ptF31 和ptB31 各 0· 2μΜ，dNTP 0.35μM，2.5yL10X^572.0DNA聚合酶緩沖液，0.8M甜菜堿，1.5yLMgS04 (100mM)，l μL仍72. 0DNA聚合酶，余量ddH20補足，共25μL。7. 根據權利要求4所述環等溫擴增方法，其特征在于，所述環等溫擴增方法的反應條 件為：65°C反應60min。8. -種快速檢測桑尼短體線蟲的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所 述外側引物對ptF31/ptB31和內側引物對ptFIPl/ptBIPl。9. 根據權利要求8所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒所使用的檢測方法為權利要 求4所述環等溫擴增方法。10. 權利要求4所述環等溫擴增方法或權利要求8所述試劑盒在檢測桑尼短體線蟲方 面的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增引物組。所述引物組包括外側引物對ptF31/ptB31和內側引物對ptFIP1/ptBIP1，引物的序列分別如SEQ？ID？NO.1～4所示。本發明以該引物組建立了環等溫擴增方法，以樣品DNA為模板進行環等溫擴增，反應結束后可通過兩種方式判斷結果：一是擴增產物進行電泳，出現特異階梯狀條帶的樣品判定為陽性；二是通過向反應體系中加入SYBR？green？I，通過肉眼觀察出現顏色變化的樣品為陽性。該環等溫擴增方法對儀器設備要求低、快速、安全、特異性好、敏感性強，為桑尼短體線蟲的檢測，尤其是基層檢疫單位對桑尼短體線蟲的快速檢測工作提供了技術支持，具有很好的推廣應用價值。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105349687
【申請號】CN201510940048
【發明人】林康藝
【申請人】林康藝
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月15日