一種快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物病原物檢測技術領域。更具體地，涉及一種快速檢測桑尼短體線 蟲的環等溫擴增引物及其應用。
【背景技術】
[0002] 短體線蟲，也稱為根腐線蟲，是一種重要的迀移性內寄生線蟲。這類線蟲能在植物 跟內移動、穿刺和取食會，同時會引起根組織形成壞死斑、空腔進而使根組織壞死。由于根 部壞死，所以被根腐線蟲危害的植物會表現出缺水和營養不足的癥狀。短體線蟲是造成農 作物損失最多的三種植物線蟲之一，其中桑尼短體線蟲（Pratylenchusthoreni)是最重要 的短體線蟲之一。它們不單分布廣泛，而且可以侵染多種重要的農作物。但是，不同種類作 物或不同的品種對桑尼短體線蟲的抗病性和耐病性有差異，因此，輪作和種植抗病品種是 防治這種短體線蟲的有效方法。如此一來，只有正確的鑒定這種線蟲，才能在實際工作中選 擇合適的作物或品種種植來防治它們。
[0003] 但是，目前主要還是通過形態學的方法進行鑒定，而形態學鑒定桑尼短體線蟲和 桑尼短體線蟲是一個復雜和耗費大量時間的工作，而且對于大部分人來說這是一個非常困 難的工作，往往也會造成準確性低的問題。此外，形態學的鑒定方法只能準確的鑒定短體線 蟲的成熟雌蟲，但是在田間調查的時候，常常會分離到大量不同齡期的幼蟲。因此，要通過 形態學方法準確的鑒定桑尼短體線蟲幼蟲，目前在技術上還是不可能的。
[0004] 目前，國外有報道通過PCR或實時熒光PCR方法檢測和定量桑尼短體線蟲的方法， 但是，該方法需要使用昂貴的PCR儀，而且，還需要進行電泳檢測，對操作人員的技術要求 較高，不利于在基層檢測單位中推廣和使用。因此，在實際的應用中，使用環等溫擴增的方 法檢測桑尼短體線蟲會大大減輕的基層人員的工作量和檢測成本。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是克服現有桑尼短體線蟲檢測技術的不足，為解決快速 檢測桑尼短體線蟲提供一組引物組和檢測方法。
[0006] 本發明的目的是提供一種快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增引物。
[0007] 本發明另一目的是提供上述環等溫擴增引物的應用。
[0008] 本發明上述目的通過以下技術方案實現：
[0009] 一種快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增引物，包括外側引物ptF31/ptB31和內 側引物ptFIPl/ptBIPl;引物ptF31的序列（如SEQIDNO. 1所示），引物ptB31的序列（如 SEQIDN0. 2所示），引物ptFIPl的序列如（SEQIDN0. 3)所示，引物ptBIPl的序列（如 SEQIDN0. 4 所示）。
[0010] 上述環等溫擴增引物在檢測桑尼短體線蟲方面的應用或者在制備檢測桑尼短體 線蟲的試劑或試劑盒方面的應用，也都應在本發明的保護范圍之內。
[0011] -種快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增方法，該方法是以樣品DNA為模板，利 用上述引物對ptF31/ptB31和引物對ptFIPl/ptBIPl進行環介導等溫擴增反應。
[0012] 所述環介導等溫擴增反應結果的判定方法為：將擴增產物進行凝膠電泳，如果出 現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有桑尼短體線蟲DNA，即為桑尼短體線蟲陽性；或者 向擴增產物中加入SYBR green I或鈣黃綠素，如果擴增產物由橘紅色變為淺綠色，則判定 樣品中含有桑尼短體線蟲DNA，即為桑尼短體線蟲陽性。
[0013] 優選地，所述環等溫擴增方法的反應體系為：1μLDNA，引物ptFIPl和ptBIPl各 1. 6μM，引物ptF31 和ptB31 各 0· 2μM，dNTP0· 35μM，2. 5μL10XBST2. 0DNA聚合酶緩沖 液，0· 8Μ甜菜堿，L5μLMgS04 (100mM)，1μLBST2. 0DNA聚合酶，余量ddH20補足，共 25μL。
[0014] 優選地，所述環等溫擴增方法的反應條件為：65°C反應60min。
[0015] -種快速檢測桑尼短體線蟲的試劑盒，所述試劑盒包括上述引物對ptF31/ptB31 和引物對PtFIPl/ptBIPl。
[0016] 所述試劑盒所使用的檢測方法即為上述環等溫擴增方法。
[0017] 上述環等溫擴增方法或上述試劑盒在檢測桑尼短體線蟲方面的應用也都在本發 明的保護范圍之內。
[0018] 本發明通過大量的研究和探索，最終得到的引物對ptF31/ptB31和引物對 ptFIPl/ptBIPl配合使用，建立的環等溫擴增方法，不僅能夠非常特異的檢測桑尼短體線 蟲，而且檢測靈敏性達到了單條，甚至是0. 1條的靈敏度，檢測效果非常好。而且環等溫擴 增方法不需要依賴于任何昂貴的儀器，對實驗檢測人員的要求也很低，是一種安全、簡單、 快速、成本低的檢測方法。
[0019] 本發明具有以下有益效果：
[0020] 本發明提供了一組快速檢測桑尼短體線蟲的環等溫擴增引物。所述引物特異性 強、靈敏度好、且具有很好的重復性。本發明利用所述引物進行環介導等溫擴增反應檢測桑 尼短體線蟲，檢測靈敏性達到了單條，甚至是0. 1條的靈敏度。
[0021] 本發明僅需使用簡單的恒溫儀器就能完成全部的檢測，不需要依賴于任何昂貴的 儀器，并且檢測時間僅為60min，比普通的熒光定量PCR方法節省了 2~3h，簡單快速、對環 境要求低、無需大型儀器，非常適合在基層檢測單位中使用。
[0022] 另外，本方法檢測結果的判定方法多樣，可根據實際情況進行選擇。本方法還可以 實現擴增反應結果的可視化，準確可靠，無需電泳檢測，不使用溴化乙錠，保障了工作人員 的安全，為桑尼短體線蟲的檢測，尤其是檢驗檢疫工作提供了技術支持，具有非常好的推廣 應用價值。
【附圖說明】
[0023] 圖1為不同引物的LAMP電泳圖對擴增效率的影響。
[0024] 圖2為引物組1的LAMP特異性檢測結果。圖中3~8為不同種群的桑尼短體線 蟲，1，2,9~24為非靶標線蟲（具體種類見表1)。
[0025] 圖3為引物組2的LAMP特異性檢測結果。圖中3~8為不同種群的桑尼短體線 蟲，1，2,9~24為非靶標線蟲（具體種類見表1)。
[0026] 圖4為不同濃度的線蟲DNA的可視化檢測結果，0. 1、1、10和100表示使用的DNA 來自于〇. 1、1、1〇和100條桑尼短體線蟲，CK表示使用滅菌水作為模板。
[0027] 實施例1引物設計
[0028] 1、根據NCBI中多種短體線蟲的28s核糖體DNA序列（基因登錄號為：EU130854、 JX046968、KM200579、JQ303333、JX261951、JX261960、JX261954、EU130875、EU130866、 EU130873、EU130845、JN244270、EU130889、HQ662581、JN091970、AM231916、JX261948、 肝765435、〇0498832、幾047005、幾003994、《]214114、幾144360)，設計引物如下 ：
[0029] (1)引物組 1:
[0030] 外側引物ptF31 (如SEQIDNO. 1 所示）
[0031] 5' -TGAAACACGGACCAAGGAGT-3'
[0032]外側引物ptB31 (如SEQIDNO. 2 所示）
[0033] 5, -CACCATCTTTCGGGTCTCAC-3，
[0034] 內側引物ptFIPl(如SEQIDNO.3 所示）：
[0035] 5' -GCGAGGGATGCCTTCACTTTCAtttaaaTTATCGTGTGCGCAAGTCAT-3'
[0036] 內側引物ptBIPl(如SEQIDNO. 4 所示）：
[0037] 5, -GGTGTCCGAGTGCAGCATGGttttttGCGTACGCTCTTCCTCCA-3'
[0038] (2)引物組 2
[0039] 外側引物ptF32 (