枝霜疫霉菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中荔枝霜疫霉菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果:
1、結果可靠:本發明所設計出的LAMP檢測引物，已經對源于我國福建、廣東、廣西、臺灣等地的荔枝霜疫霉菌和帶荔枝霜疫霉菌的植物組織進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證；
2、特異性強:本發明所采用的LAMP引物是針對荔枝霜疫霉菌辦^基因序列中6個不同區域設計出4條特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性高。
[0019]3、靈敏度高:LAMP對荔枝霜疫霉菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10fg/25PL。
[0020]4、實用性好:本發明所設計出的LAMP引物，可用于帶荔枝霜疫霉菌的組織中高靈敏度快速檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對帶菌組織中存在的荔枝霜疫霉菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要；
5、操作簡便快速:應用本發明方法，對帶荔枝霜疫霉菌的組織進行檢測可在數小時內完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要復雜的儀器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明荔枝霜疫霉菌的特異LAMP檢測結果圖。其中:泳道Μ為DL 2000DNA marker，泳道1為陰性對照，泳道2 -5為不同來源荔枝霜疫霉菌；泳道6_12為其他卵菌和真菌菌株。
[0022]圖2為本發明荔枝霜疫霉菌的LAMP靈敏度檢測結果圖。其中:泳道Μ為DL 2000 DNA marker,泳道 1 為陰性對照，泳道 2-9 分別為:1 ng/^L，100 pg/ μ L，10 pg/ μ L，
1 pg/ μ L, 100 fg/ μ L, 10 fg/ μ L, 1 fg/μ L、lOOag/μ L 的不同濃度蒸枝霜疫霉菌 DNA。
[0023]圖3為本發明發病植株的檢測結果圖。其中:泳道Μ為DL 2000 DNA marker，泳道1為陰性對照，泳道2為陽性對照；泳道3-5，7-9為發病的荔枝霜疫病植株；6、10為健康的荔枝植株。
【具體實施方式】
[0024]本發明的技術內容包括荔枝霜疫霉菌的LAMP檢測引物，LAMP引物及其序列分別為:
F3:5’ -CCGTACGATCGAGCTGGA-3’
B3:5’ -CCGTCACGTCGTACACCA-3’
FIP:5’ -TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3，
BIP:5’ -GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’
利用LAMP引物檢測荔枝霜疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶。
[0025]實施例1:LAMP引物對荔枝霜疫霉菌的特異性擴增
1.荔枝霜疫霉菌的LAMP特異檢測
①LAMP反應體系為 25.Ομ?:包括F3 與 Β3 各0.2μΜ，FIP 與 BIP 各 1.6μΜ, 1 X ThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜堿，6.0 mM 硫酸鎂，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，50 ng模板DNA，50 μΜ鈣黃綠素，500 μΜ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0026]所述的LAMP反應條件為在63°C溫育60 min, 80°C保溫5min。
[0027]②LAMP反應結束后，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橘黃色判斷為陰性；或取2PL擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0028]2.檢測結果
檢測的特異性:除了來自我國福建、廣東、廣西、臺灣等省的21株荔枝霜疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶外，檢測了其它13種不同卵菌及8種真菌菌株顯色結果為橘黃色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現擴增條帶，說明此引物具有很強的特異性。
[0029]實施例2:LAMP引物對荔枝霜疫霉菌的靈敏度檢測
1.荔枝霜疫霉菌的LAMP靈敏性檢測
采用10倍濃度系列稀釋法將提取的荔枝霜疫霉菌DNA稀釋成1 ng/^L，100 pg/ μ L，10pg/ μ L，1 pg/ μ L，100 fg/ μ L，10 fg/ μ L，1 fg/ μ L、lOOag/ μ L 共 8 個不同濃度梯度。
[0030]①LAMP反應體系為25 uL:包括F3與B3各0.2M, FIP與BIP各1.6μΜ，1 X Thermopol Buffer, 1.0 mM dNTPs, 0.8 M 甜菜喊，6.0 mM 硫酸儀，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，1 μ?模板DNA，50 μ Μ鈣黃綠素，500 μ Μ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0031]所述的LAMP反應條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。
[0032]②LAMP反應結束后，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橘黃色判斷為陰性；或取2 μ L擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0033]2.檢測結果:荔枝霜疫霉菌LAMP靈敏度檢測，顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶，檢測靈敏度可達10 fg/25 μ L。
[0034]實施例3:發病組織中荔枝霜疫霉菌的檢測
1.樣品采集:植物組織樣品采自福建福州市荔枝生產基地。
[0035]2.DNA提取及檢測
發病植物組織采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌DNA。
[0036]按下述方法進行LAMP檢測:
① LAMP 反應體系為 25 μ?:包括 F3 與 B3 各 0.2μΜ，FIP 與 BIP 各 1.6μΜ，1 X ThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜堿，6.0 mM 硫酸鎂，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，1 μ?模板DNA，50 μ Μ鈣黃綠素，500 μ Μ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0037]所述的LAMP反應條件為在63°C溫育60 min, 80°C保溫5min。
[0038]②LAMP反應結束后，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橘黃色判斷為陰性；或取2PL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0039]3.檢測結果
顯色結果觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶，判斷發病組織中感染荔枝霜疫霉菌。
[0040]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種荔枝霜疫霉菌的LAMP引物，其特征在于:所述LAMP引物如下: 外側引物:F3:5’ -CCGTACGATCGAGCTGGA-3’ ；B3:5’ -CCGTCACGTCGTACACCA-3’ ； 內側引物:FIP:5’ -TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3’ ；BIP:5’ -GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’。2.一種荔枝霜疫霉菌的LAMP檢測方法，其特征在于:利用權利要求1中所述的LAMP引物進行檢測；LAMP反應體系為25 μι:包括F3與B3各0.2μΜ，FIP與BIP各1.6μΜ，lXThermopol Buffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜堿，6.0 mM 硫酸鎂，0.1% Tween-20,8 UBst DNA聚合酶為，50 ng模板DNA，50 μΜ鈣黃綠素，500 μ Μ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足；所述的LAMP反應條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。3.根據權利要求2所述的荔枝霜疫霉菌的LAMP檢測方法，其特征在于:在LAMP反應體系中，以50 μM Calcein-500 μΜ MnCl2S顯色劑，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橘黃色判斷為陰性；或取2uL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性，沒有出現則判斷為陰性。4.如權利要求1所述的荔枝霜疫霉菌的LAMP引物用于田間荔枝霜疫霉病的早期診斷和病菌的監測和鑒定。
【專利摘要】本發明公開了一種荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于荔枝霜疫霉菌特異檢測。主要采用設計了一種荔枝霜疫霉菌的LAMP引物，經過恒溫擴增肉眼觀察或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色熒光或出現LAMP特征性的梯形帶。所發明的LAMP引物及其用法可被用于生產實踐中荔枝霜疫霉菌感染的植株中荔枝霜疫霉菌的快速、靈敏、準確的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，為荔枝霜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技術和理論依據。
【IPC分類】C12R1/645, C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號】CN105331714
【申請號】CN201510820807
【發明人】李本金, 陳慶河, 劉裴清, 劉小麗, 翁啟勇
【申請人】福建省農業科學院植物保護研究所
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月24日