一種荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于荔枝霜疫霉菌高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間荔枝霜疫霉病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。
【背景技術】
[0002]荔枝霜疫霉病是我國荔枝產區普遍發生且危害嚴重的病害，其病原菌為荔枝霜疫霉售i iperonophythora litchii)0該病于1978年在我國臺灣首次報道，目前在廣東、廣西、福建、海南臺灣等地均有發生，不僅嚴重為害接近成熟的果實，也為害嫩梢、葉片、花穗、結果小枝、果柄及幼果，引起大量落花、落果、裂果和爛果，產量損失高達80%以上，甚至絕收，是造成荔枝長期單產低且不穩產的主要原因之一，此外，該病在荔枝果實貯運期仍繼續危害，嚴重影響產量、品質以及鮮果的儲運和外銷，造成巨大的經濟損失，影響荔枝產業可持續穩定發展。
[0003]目前對荔枝霜疫霉病的檢測大多仍沿用傳統培養和血清學鑒定方法。傳統荔枝霜疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特性等，程序繁瑣，所需時間較長且靈敏度較低，鑒定時還易受人為及環境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢測出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期，而免疫血清學鑒定方法雖已建立，但是血清的制備過程耗時耗力，常常受到抗血清質量的影響，且可能存在交叉反應，特異性較差，容易造成假陽性，因此這些方法的應用均受到一定的限制。
[0004]PCR技術為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優勢，但由于目前PCR檢測技術仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，限制了該檢測方法的推廣應用。環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)具有簡單、快速、高效、經濟等特征。該技術可在60°C~65°C恒溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶DNApolymerase)對目的DNA片段進行特異性擴增。在1個小時內，能夠將少量拷貝數的目的基因擴增至109個拷貝數。LAMP反應產物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進行檢測，而且還可以通過SYBR Green 1、鈣黃綠素、羥基萘酚藍染色后，肉眼識別。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等特征，因而具有極為廣泛的應用前景。目前LAMP檢測主要應用于人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中報道較少，關于荔枝霜疫霉菌的LAMP檢測國內外均未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對現有技術中荔枝霜疫霉菌的生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種荔枝霜疫霉菌的LAMP檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速檢測方法。
[0006]實現本發明的目的包括下列步驟:
1.LAMP引物的設計
對荔枝霜疫霉菌序列進行擴增、克隆、測序，獲得的荔枝霜疫霉菌7/^7序列，應用在線 LAMP 引物設計軟件primer software PrimerExplorer V4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html; Eiken Chemical C0., Japan)設? 套LAMP檢測引物，包括1對外引物(F3和B3)和1對內引物(FIP和BIP)，引物序列分別為:
外側引物:
F3:5’ -CCGTACGATCGAGCTGGA-3’ ；
B3:5’ -CCGTCACGTCGTACACCA-3’ ；
內側引物:
FIP:5’ -TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3’ ；
BIP:5’ -GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’ ；
2.荔枝霜疫霉菌快速檢測體系的建立
所述的LAMP反應體系為25.0 4 1^包括？3與83各0.2卜]\1，FIP與BIP各1.6μΜ，1 X Thermopol Buffer, 1.0 mM dNTPs, 0.8 M 甜菜喊，6.0 mM 硫酸儀，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，50 ng模板DNA，50 μΜ鈣黃綠素，500 μΜ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0007]所述的LAMP反應條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。
[0008]所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法:在LAMP反應體系中以50 μ Μ鈣黃綠素-500 μ Μ氯化錳為顯色劑，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橘黃色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法:取2uL LAMP產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0009]該方法可用于帶菌植株的高靈敏度快速檢測。建立荔枝霜疫霉菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監測技術體系，對于荔枝霜疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
本發明的關鍵性技術是荔枝霜疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證荔枝霜疫霉菌的特異引物序列，本發明以我國福建、廣東、廣西、臺灣等省的21株荔枝霜疫霉菌和其它13種不同卵菌及9種真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下:取0.lg冷凍干燥后的菌絲粉于5.0mL離心管中，加入2mL65°C預熱的2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(提取液的配方為:2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，pH 8.0 ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和0.2%巰基乙醇)充分混勻后，于65°C水浴lh，每10 min振蕩混勻一次。水浴結束后取出，放至室溫。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)，充分顛倒混合，將提取液中含有的蛋白雜質變性，分裝至2.0mL離心管中，室溫下12，OOOrpm離心lOmin。將上清液(水相)轉移到新1.5mL離心管中，向上清中加入1倍體積異丙醇，充分顛倒混勻，使DNA從溶液中析出，形成絮狀沉淀(可室溫或-20°C放置l-2h促進DNA沉淀)，4°C離心，12，OOOrpm, 20min。棄上清，加入500μ?70%乙醇洗滌，顛倒混勻，至沉淀懸起，4°C，12，OOOrpm離心5min。重復洗滌一次，棄酒精，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后加入適量無菌雙蒸水溶解DNA，DNA溶解后，按樣品體積加入1/10體積的 RNaseA (10mg/mL)并在 37°C處理 lOmin，去除 RNA，得到 DNA 溶液，用 NanoDrop 檢測 DNA濃度并稀釋備用。
[0010]經對供試菌株和21株荔枝霜疫霉菌的特異性進行LAMP驗證。
[0011]LAMP反應體系為 25 uL:包括F3 與 B3 各0.2μΜ，FIP與 BIP各 1.6μΜ，1 XThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜堿，6.0 mM 硫酸鎂，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，50 ng模板DNA，50 μΜ鈣黃綠素，500 μΜ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0012]所述的LAMP反應條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。
[0013]除了來自我國福建、廣東、廣西、臺灣等省的21株荔枝霜疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出現LAMP特征性的梯形帶，檢測了其它13種不同卵菌及9種真菌顯色結果為橘黃色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現擴增條帶。這說明該引物可被用于生產實踐中發病組織及土壤中荔枝霜疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。
[0014]當在用于荔枝組織中存在荔枝霜疫霉菌時，采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌的DNA，具體過程如下:(1)將荔枝病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發病部位；(2)按lmg病葉加入10uL (0.5mol/L NaOH,0.5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12，000g離心機中離心5min ； (3)取上清20uL與等體積的0.1 mol/L的Tris-HCl (pH8.0)混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍，分別取1 μ?原液、10倍、100倍、1000倍液作為LAMP模板進行等溫擴增。
[0015]按如下LAMP反應體系和反應條件用所設計的引物進行檢測:
① LAMP 反應體系為 25 uL:包括 F3 與 B3 各 0.2μΜ，FIP 與 BIP 各 1.6μΜ，1 X ThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜堿，6.0 mM 硫酸鎂，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，1 μ?模板DNA，50 μ Μ鈣黃綠素，500 μ Μ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0016]所述的LAMP反應條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。
[0017]②LAMP反應結束后，顯色結果觀察到綠色熒光，或取2uL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果出現LAMP特征性的梯形帶，即可判斷所述的荔枝組織中存在荔枝霜疫霉菌；否則所述的荔枝組織中不存在荔枝霜疫霉菌。
[0018]本發明有益效果:本發明方法適用于發病組織中荔