分子修飾融合蛋白的分子量相當（PEG表觀分子量+融合蛋白 分子量），表明在修飾過程中，PEG對融合蛋白的修飾位點可W有Η個，并可同時實現修飾。 PEGi。。。。的修飾產物中，只出現了單點修飾和二點修飾，未見有明顯的；點修飾條帶。PEG2。。。。 的修飾產物中，只出現了一個條帶，可能只有明顯的單點修飾發生。出現送種情況可能的 原因是分子量越大，相對移動速度就越低，因此產生修飾所需的碰撞概率就降低，從而導致 PEG分子量越大，修飾越困難。如果PEG的分子量過小，有可能會導致修飾后對蛋白的保護 作用也相應減弱，因此，綜合考慮選擇PEGw。。作為后續實驗的分子量。
[0042] 3重融合蛋白濃度對產物修飾率的影響
[0043] 融合蛋白濃度對產物修飾率的影響結果見圖3。
[0044] 從圖中可W看出，融合蛋白濃度在0. 4mg/mL~0. 7mg/mL時，修飾率較高，其中在 0. 6mg/mL時修飾率最高，達到84%。按一級化學反應理論，反應物的濃度越高，反應速度越 快，因此隨蛋白濃度的升高，修飾反應速度應該越來越快，但修飾率卻并未一直隨蛋白濃度 升高而增加，反而在高濃度時出現下降的，送可能是因為蛋白濃度升高后，在PEG濃度不變 的情況下，PEG受限所引起。綜合各方面情況，選擇0. 6mg/mL為最佳蛋白濃度。
[0045] 4蛋白與PEG摩爾比對融合蛋白修飾率的影響
[0046] 蛋白與PEG摩爾比對融合蛋白修飾率的影響結果見圖4。
[0047] 從圖中可W看出，蛋白與陽Gg。。。的摩爾比為1 : 10時，融合蛋白的修飾率達到最 大值。低于1 : 10修飾率下降，可能是PEG摩爾濃度低，反應速率下降的原因。摩爾比超 過1 : 10后，反應速率越下降，可能是由PEG自身濃度升高后，體系粘度也升高，導致PEG 擴散速率下降所致。綜合W上實驗結果，應選擇蛋白與PEGs。。。的摩爾比為1 : 10為最佳反 應條件。
[0048] 5反應時間對融合蛋白修飾率的影響
[0049] 反應時間對融合蛋白修飾率的影響見圖5。
[0050] 從圖5中可W看出，PEG對融合蛋白的修飾反應速度在2小時W內較快，修飾率直 線上升，至2小時時，修飾率已經達到75%W上。2小時之后，反應速率逐漸下降，至第4小 時后，反應速率趨于零，表現為修飾率自2小時后上升速度逐漸降低，至4小時后，累積修飾 率達到85%W上后，基本不在上升，維持平衡。從盡可能提高修飾速率的角度考慮，選擇4 小時為最佳修飾反應時間。
[0051] 6反應溫度對融合蛋白修飾率的影響
[0052] 反應溫度對融合蛋白修飾率的影響見圖6。
[0053] 從圖中可W看出，溫度對提高融合蛋白修飾率未有明顯的影響。根據化學反應的 一級方程理論，隨溫度升高分子擴散加快，反應速率相應上升，但在本實驗中，并未表現出 對修飾速率的影響。因此融合蛋白修飾的速度可能受溫度的影響，在反應時間4hW上，溫 度并不會對修飾率產生明顯影響。溫度對修飾速率影響的具體情況需要進一步研究。從更 好保持蛋白的穩定性角度考慮，選擇4°C為融合蛋白修飾反應的溫度。
[0054] 7抑對融合蛋白修飾率的影響
[005引抑對融合蛋白修飾率的影響見圖7。
[005引從圖7中可W看出，隨抑的升高，修飾率逐漸升高。陽G與蛋白的修飾反應主要是PEG的居基與蛋白氨基酸殘基的氨基或駿基發生縮合反應。堿性環境對居基的縮合反應有 利，酸性環境卻有利于醋鍵的水解。因此，在堿性環境下，PEG對融合蛋白的修飾能力將會 加強。從實驗結果看，在pH9左右時，反應速率達到最高值，因此pH9為PEGs。。。對化-37與 IFN-α2a融合蛋白修飾的最佳抑條件。
[0057] 8修飾產物的體外活性檢測
[005引經檢測，α-37與IFN-a2a融合蛋白中原始干擾素的活性為7. 86X106IU/mg。經 上述探索的最佳工藝修飾后，化-37與IFN-a2a融合蛋白的活性為4. 58X106IU/mg，干擾 素活性保持率為58. 3%。另外，化-37與IFN-α2a融合蛋白原始的抗菌活性為1. 32cm/mg， 修飾后為1. 28cm/mg，抗菌活性保持率為97. 0 %，表明PEG對化-37與IFN-α2a融合蛋白 的修飾對其中Lk37部分沒有明顯的影響。
[0059] 9修飾產物的半衰期
[0060] 為了比較和測定陽G修飾的人IFN-α2a和人α-37融合蛋白的代謝，采用了SD 大鼠皮下注射給藥，不同時間點采取血液樣品并特異性檢測人源IFN-a2曰。SD大鼠皮下注 射陽G修飾的人IFN-α2a和人化-37融合蛋白5μg/kg，對照組皮下注射IFN-α2a2. 5μg/ kg。注射后采集外周血，用ELISA檢測血液中的IFN-α2a蛋白濃度。結果顯示，IFN-α2a 標準蛋白注射的大鼠在4.化后血藥濃度達到峰值12. 3ng/mL，9.化下降為6. 15ng/mL，17 小時后恢復至底線。而PEG修飾的人IFN-α2a和人化-37融合蛋白的吸收較為緩慢，在 注射后16.化達到血藥峰值18. 3ng/mU至7化達到半衰期，血液中可檢測到存留時間直到 140hW上。
【主權項】
1. 一種聚乙二醇修飾的人干擾素與人抗菌肽融合蛋白。2. 權利要求1的人干擾為人IFN-α2a。3. 權利要求1的人抗菌肽為人LL-37。4. 權利要求1的人干擾素與人抗菌肽融合蛋白，是由人IFN-a2a與人LL-37之間由接 頭GlyGlyGlyGlySer連接而成。5. 權利要求1的聚乙二醇修飾的人干擾素與人抗菌肽融合蛋白，系由人IFN-a2a與人 LL-37融合蛋白，在PEG分子量為5000、融合蛋白濃度為0. 6mg/mL、蛋白與PEG5_的摩爾濃 度比為1 : 10、反應溫度為4°C、反應時間為4h、pH為9.0等條件下修飾而成。6. 權利要求1的聚乙二醇修飾的人干擾素與人抗菌肽融合蛋白同時具有人IFN-α2a 的抗病毒活性與人LL-37的抗細菌活性。7. 權利要求1的聚乙二醇修飾的人干擾素與人抗菌肽融合蛋白在動物體內的半衰期 相對于單體的IFN-α2a由9. 3h延長了到78h以上。
【專利摘要】本發明公開了一種聚乙二醇修飾的人干擾素IFN-α2a與人抗菌肽LL-37融合蛋白。所獲得的IFN-α2a與LL-37融合蛋白同時具有IFN-α2a的抗病毒活性和LL-37的抗菌活性，同時其大鼠體內半衰期由單用IFN-α2a的9.3小時延長到78小時以上。
【IPC分類】C07K19/00
【公開號】CN105330746
【申請號】CN201410399634
【發明人】萬徐萍
【申請人】廣東紫金正天藥業有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2014年8月14日