一種聚乙二醇修飾的人干擾素與人抗菌肽融合蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域
【背景技術】
[0002] 化thelicidin家族是一類在哺乳動物、禽類、魚類及爬行動物體內表達的保守的 抗菌膚。化-37是人體唯一合成的化thelicidin家族抗菌膚，主要由免疫細胞和上皮細 胞表達合成。Lk37的序列為LLGDFF服SKEKIGKEFKRIVQRI邸化RNLVPRTES，因前兩個均為 LL(亮氨酸）且序列長度為37而得名。α-37通過結構中形成的正6個正電荷的雙親超螺 旋與細菌細胞膜磯脂的親水部結合，然后其疏水部翻轉插入磯脂雙分子層，從而引起細胞 膜的破壞。Lk37對革蘭氏陽性和陰性菌均有效果，其抗菌譜廣，受到研究與應用領域的廣 泛重視。
[0003] 干擾素是由免疫細胞產生的一類糖蛋白，具有抗腫瘤、抗病毒和調節免疫的作用， 在臨床上獲得廣泛應用。干擾素在臨床上使用存在的主要問題是由于其分子量小，容易被 血清中的蛋白酶降解和被腎小球過濾掉。克服干擾素使用過程中缺陷的有效手段，一是通 過融合表達，增加分子量；二是通過表面修飾，防止蛋白酶的降解。
【發明內容】
[0004] 1PEG表觀質量檢測
[0005] 陽G5000、PEG10000、陽G20000用測酸-測砂緩沖液（pH9. 0)溶解成終濃度lOmg/ mL。進行SDS-PAGE分析，采用而礙染色，用凝膠成像系統拍照。
[0006] 2PEG分子量對修飾產物的影響
[0007] 配制蛋白濃度〇.6mg/mL3份，按蛋白：陽G(摩爾比）=1 : 10分別加入 mPEG5000-SS、陽G10000-SS和陽G20000-SS，反應條件為 4°C、6h，取樣進行SDS-PAGE分析。
[0008] 3融合蛋白濃度對產物修飾率的影響
[0009]按濃度梯度 0. 2mg/mL、0. 4mg/血、0. 6mg/血、0. 8mg/血、1.Omg/血、1. 2mg/mL,蛋 白：mPEG-SS(摩爾比）=1 : 10修飾反應液，反應條件為4°C、6h，取樣分析融合蛋白修飾 率。
[0010] 4蛋白與mPEG-SS摩爾比對產物修飾率的影響
[0011] 在上述確定的最佳蛋白濃度下，分別取蛋白：mPEG-SS(摩爾比）=1 : 5、1 : 10、 1 : 15、1 : 20、1 : 25制備修飾反應液，反應條件為4°C、6h，取樣分析融合蛋白修飾率。
[0012] 5反應時間對產物修飾率的影響
[0013] 在前述確定的蛋白濃度、蛋白PEG摩爾比、溫度條件下，制備7份反應液，分別反應 化、地、化、她、lOh、12h、1地，取樣分析融合蛋白修飾率。
[0014] 6反應溫度對產物修飾率的影響
[0015] 在前述確定的蛋白濃度與蛋白PEG摩爾比的條件下，制備4份修飾反應液，分別在 4°C、1(TC、2(TC、3(TC條件下反應化，取樣分析融合蛋白修飾率。
[0016] 7抑對融合蛋白修飾率的影響
[0017] 在前述確定的最優條件下，制備10份反應液，分別調節抑為5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、 7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5,取樣分析融合蛋白修飾率。
[0018] 8聚己二醇修飾的人干擾素與人抗菌膚融合蛋白
[0019] 8. 1相對分子質量與修飾率的測定
[0020] 通過凝膠電泳成像系統獲得凝膠圖譜，用系統軟件進行掃描分析。根據蛋白 Marker估計PEG及其修飾產物的相對分子質量，并按下式計算蛋白修飾率：
[0021]
[0022] 8. 2修飾產物的體外活性檢測
[0023] 修飾產物的干擾素活性按《中國藥典》Η部（2010版）附錄中干擾素將從測定方 法檢測其體外活性，并對照原料蛋白活性，計算活性保留率。
[0024] 修飾產物的抗菌活性用大腸桿菌ATCC25922作為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法 測定。底層培養基上打直徑3mm的圓孔，每孔加10μL發酵液，37°C賠化化后，在底層上覆 蓋一層營養瓊脂，37°C繼續培養20h，測量無菌生長的透明圈直徑。并對照原料蛋白活性，計 算活性保留率。
[0025] 8. 3修飾產物半衰期的測定
[0026] 從皮下給SD大鼠單劑量注射人IFN-α2a或經PEG修飾的人IFN-α2a與人化-37 融合蛋白，注射劑量分別為2. 5μg/kg和5μg/kg。選取不同的時間點抽取SD大鼠的血液 樣品，肝素抗凝，離必后用人IFNαELISA試劑盒測定血漿中融合蛋白的量。
【附圖說明】
[0027] 圖 1 陽G日。。。、陽Gi。。。。與陽Gw。。。的SDS-PAGE圖譜
[0028] 圖2PEG分子量對化-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響
[002引注；圖中Marker為蛋白質分子量標準（低）；0為未修飾的融合蛋白；1為PEGs。。。 修飾的融合蛋白；2為PEGi。。。。修飾的融合蛋白；3為PEG2。。。。修飾的融合蛋白。
[0030]圖3融合蛋白濃度對產物修飾率的影響[003。圖4蛋白與PEG摩爾比對融合蛋白修飾率的影響
[0032] 圖5反應時間對融合蛋白修飾率的影響
[0033] 圖6反應溫度對融合蛋白修飾率的影響
[0034] 圖7抑對融合蛋白修飾率的影響
【具體實施方式】
[0035] 下面結合附圖和實施例子對本發明作進一步說明，但本發明并不限于此。
[0036] 1PEG的表觀分子量
[0037]Η種分子量的陽G的SDS-PAGE結果見圖1。
[00測與蛋白Marker相比，陽Gs。。。的分子量約為14000,陽Gi。。。。的分子量約為29000，PEG2。。。。的分量約為40000，送與其實際的分子量均偏大。PEG日圓與PEGw。。。約偏大3倍， PEGw。。。約偏大2倍。偏大的原因與SDS-PA(iE測量分子大小是依據鏈長度為標準有關。在 相同鏈長條件下，組成鏈長單元的平均氨基酸分子量要比己二醇大，故在W蛋白為標準對 照的體系中，PEG的表觀分子量就顯得偏大。
[0039] 2PEG分子量對修飾產物的影響
[0040]PEG分子量對化-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響見圖2。
[0041] 從圖中可W看出，對比未修飾的融合蛋白條帶，Η種分子量PEG修飾的融合蛋白 均未完全修飾，其中PEGg。。。修飾后殘留的未修飾所占比重最小，約為12%。在PEGg。。。所修 飾的條帶中，依次出現了Η條帶，對應分子量分別為約39000、53000和67000,送與PEGs。。。 單分子修飾、雙分子修飾和Η