ID NO. 5)。
[0017] 本發明為前列腺癌的診斷和治療提供了一種新的分子標志物MIR27A - 3P。該分 子標志物可作為標志物應用于制備診斷試劑盒中。使用該分子標志物及含有該分子標志物 的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方便、安全無創傷，且具有較高的特異性、靈敏 性和方便大量篩查的特點。該分子標志物適合應用于前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌 的鑒定、前列腺癌治療及狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測和前列腺癌預后監測等領 域。
【附圖說明】
[0018] 圖1為MIR27a - 3p在前列腺癌組織樣本中和正常組織樣本中的含量檢測。
【具體實施方式】
[0019] 為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明，但下述實施 例僅用于說明本發明而不限制本發明的范圍，下面實施例中未提及的具體實驗方法，按照 常規實驗方法進行。
[0020] 實施例1:MIR27A - 3P在前列腺癌組織樣本中和正常組織樣本中的含量檢測 本實施例主要步驟如下： 1、組織樣本中總RNA的提取 獲得前列腺癌根治術患者手術后的組織樣本，同時獲得淋巴結清掃術的患者切除的組 織樣本作為對照。提取前述組織樣本的總RNA于無 DNA和無 RNA酶污染的1. 5毫升離心管 中。
[0021] 組織樣本中提取總RNA的試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。提取的總 RNA通過使用Therm NanoDrop2000c分光光度計，測定260/280nm紫外波長的比值進行的濃 度測定。
[0022] 2、定量檢測組織樣本中的miRNA (1) 反轉錄RNA得到cDNA單鏈 按照下表1配置反轉錄體系，配置過程在冰上進行。配置好的體系在PCR儀上進行反 轉錄。反應條件為38攝氏度15分鐘，85攝氏度5秒；
表1中X表示加入的RNA體積由RNA濃度來確定，本實驗中為X = 500鈉克/ RNA濃 度。前述反轉錄試劑盒購自大連寶生物有限公司（Takara); (2) QPCR定量檢測 以cDNA稀釋液為實時定量PCR模板，引物終濃度為200nM，反應總體積為10 μ 1。實 時定量PCR儀器使用ABI 7900HT sequence Detection System，用384孔板完成。每個樣 本重復二到三次。在溶解曲線基本符合要求無非特異性擴增的情況下，參考操作手冊，采用 threshold cycle (Ct)方法獲得相對表達量，以RNU6為內參。具體程序參看表2 ;
(3)采用Array Tools4. 1. 0進行數據分析 用前述方法可測得樣品中目標miRNA和參照miRNA的Ct值水平求得目標miRNA在組 織中的相對含量。用RNU6為參照矯正miRNA的量，通過QPCR檢測中經典的2 Aet的方法表 示組織樣本中miRNA的水平（-Δ Ct為目標miRNA與對照的Ct值之差)。
[0023] 3、組織樣本中MIR27A - 3P水平診斷前列腺癌 如圖1，與正常對照組織樣本中MIR27A - 3P的高含量相比，前列腺癌患者組織樣本中 的MIR27A - 3P含量相對較高，且普遍高于正常組織樣本的平均值，正常樣本平均值約為腫 瘤樣本的平均值的〇. 3倍，差異有統計學意義。
[0024] 實施例2:本前列腺癌的診斷試劑盒的應用 本實施例主要步驟如下： 1、組織樣本、血液、尿液中總RNA的提取 按照每50mg組織或200ul血液或200ul尿液使用lmL的Trizol試劑的量處理組織樣 本、血液、尿液，吹打均勻后轉移到無 RNA酶的1. 5ml Ep管中；向勻漿中加入1/5體積的氯 仿，振蕩離心管至溶液乳化成乳白狀，無分相，12000 rpm 4°C離心15min ;吸取上清至新管， 加入等體積異丙醇，輕輕混勻，-20°C 2h沉淀；12000 rpm 4°C離心10min ;棄上清，沿管壁 輕輕加入lml 75%乙醇，輕洗EP管，12000 rpm 4°C離心2min;棄上清，短暫離心，用槍吸 去剩余上清，置于通風櫥內晾干；加入適量DEPC水，用槍吹打使沉淀溶解；定量：電泳檢測 抽提質量，紫外分光光度計檢測0D260/0D280和樣品濃度；得到組織樣本、血液、尿液中總 RNA，放置-80°C保存。
[0025] 2、檢測組織樣本、血液、尿液中的MIR27A - 3P相對前列腺正常組織表達量變化 使用試劑盒中試劑，按照實施例1中反應體系與條件，使用試劑盒中前列腺正常組織 cDNA作為QPCR定量檢測中的對照cDNA，檢測組織樣本、血液、尿液中的MIR27A - 3P相對 前列腺正常組織表達量變化，分析檢測結果，樣本和對照間比較采用t檢驗，P〈0. 05為差異 顯著，判為檢測樣本陽性。
[0026] 以上顯示和描述了本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和本發明的優點。 本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在 不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落 入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【主權項】
1. 一種前列腺癌分子標志物，其特征在于為MIR27A- 3P，是一種miRNA，其核苷酸序 列為SEQIDNO. 1所示。2. -種前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于含有前列腺癌分子標志物MIR27A- 3P， MIR27A- 3P是一種miRNA，其核苷酸序列為SEQIDNO. 1所示。3. 根據權利要求2所述的前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于包括： (1) 組織樣本、血液和尿液中總RNA提取試劑； (2) 反轉錄試劑； (3) 定量PCR試劑； 引物為MIR27A- 3P和對照RNU6兩對引物；其中： 對照RNU6的引物序列如下： RNU6上游引物序列：SEQIDNO. 2RNU6下游引物序列：SEQIDNO. 3 ; 檢測MIR27A- 3P的引物序列如下： MIR27a- 3p上游引物序列：SEQIDNO. 4MIR27a- 3p下游引物序列：SEQIDNO. 5。4. 如權利要求1所述的前列腺癌分子標志物作為標志物在制備前列腺癌高危人群篩 選、診斷、藥物設計、治療及狀況監測、預后監測的試劑盒中及藥物中的應用，其特征在于： 通過檢測被試者血清、尿液和組織樣本中MIR27A- 3P的含量，并與正常水平MIR27A- 3P 含量相比較，以進行前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療及狀況監測、預后監測。5. 如權利要求1所述的前列腺癌分子標志物作為標志物在制備前列腺癌高危人群篩 選、診斷、藥物設計、治療及狀況監測、預后監測的試劑盒中及藥物中的應用，其特征在于： 所述被試者血清、尿液和組織樣本中MIR27A- 3P的含量通過總RNA提取、反轉錄、定量PCR 進行檢測。6. -種用于檢測前列腺癌分子標志物MIR27A- 3P的引物序列： MIR27a- 3p上游引物序列：5 '-CTAATCGTGTTCACAGTGGCTAAG-3 '， MIR27a- 3p下游引物序列：5 '-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3 '。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體為microRNA？27a－3p？(MIR27A－3P)作為一種前列腺癌分子標記物及其在診斷試劑盒中的應用。MIR27A－3P是一種miRNA，其核苷酸序列為SEQ？ID？NO.1所示。本發明包括含有前列腺癌分子標記物的前列腺癌診斷試劑盒；還包括該前列腺癌分子標志物和診斷試劑盒在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療及狀況監測、預后監測中的應用等。使用該分子標記物及含有該分子標記物的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方便、安全無創傷，且具有較高的特異性和靈敏度及易于大量篩查的特點。
【IPC分類】C12N15/113, C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105316340
【申請號】CN201510843247
【發明人】李瑤, 鮑升林, 黃文華, 萬學超, 張亞龍, 吳海
【申請人】復旦大學, 上海濟遠生物科技有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年11月28日