Mir27a-3p作為前列腺癌分子標志物及其在診斷試劑盒中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種前列腺癌分子標志物MIR27A - 3P及其 在診斷試劑盒中的應用，包括通過該生物分子標志物在前列腺癌高危人群的篩選、前列腺 癌的診斷、前列腺癌治療及狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測及前列腺癌預后檢測等 領域的應用。
【背景技術】
[0002] 根據《ASC0年度報告：2015臨床腫瘤學進展》中相關內容，液體活檢技術被 列為腫瘤治療領域下一個十年趨勢之一。血液中的一些分子標志物已經被應用于一些 疾病的診斷，如谷丙轉氨酶用于肝炎的診斷，白細胞數目用于判斷炎癥。血液循環腫瘤 DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)是一種無細胞狀態的胞外游離DNA，存在于血液、滑膜 液和腦脊液等體液中，體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統，其主要是 由短的單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質復合物或游離DNA 兩種形式存在。ctDNA來自腫瘤細胞的體細胞突變，因此，ctDNA是一種特征性的新的腫瘤 生物標記物，并且還可以被定性、定量和追蹤，將成為臨床腫瘤的早期診斷、預后判定及跟 蹤隨訪等提供一系列方便、快捷、特異、無創或微創和分子生物學檢測手段，尤其對于一些 不具有典型臨床癥狀、檢查無特異性和診斷困難的腫瘤可避免復雜的、具有創傷性的活檢。 結合新一代測序技術（NGS)將變成"液體活檢"，并替代侵入組織性活檢。
[0003] MIR27a - 3p屬于microRNA，是一類由內源基因編碼的微小RNA，不編碼蛋白，大 小為20~24個核苷酸，廣泛存在于植物、動物和各種病毒中，在RNA沉默和轉錄后翻譯調 控中發揮舉足輕重的作用。每個miRNA可以有多個靶基因，每個基因也可能受多個miRNA 調控。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾 個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達。據推測，miRNA調節著人類三分之一的基因。 MicroRNA因其高度的保守性、時空特異性、穩定性及組織特異性等特點使其優于蛋白質、 DNA片段等其他生物標志物而在疾病發病機制研究、早期診斷、個體化治療和預后等方面發 揮日益重要的作用。。
[0004] 前列腺癌是常見的男性生殖系統惡性腫瘤之一。世界范圍內，前列腺癌發病率在 男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國前列腺癌的發病率已經超過肺癌，成為第一位危害 男性健康的腫瘤。亞洲前列腺癌的發病率遠遠低于歐美國家，但近年來呈現上升趨勢，且增 長比歐美發達國家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以后發病，95%發 生于60歲以上的老年男性，發生率持續地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥 狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增 生相混淆。在我國約80%的病人首先發現遠處轉移病灶才發現前列腺癌。此時，病變已達 晚期，預后不良。
[0005] 前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有直腸指檢、血清前列腺特異性抗原（PSA)檢 測、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是最簡單、最經濟實用的方法，主要通過 醫生的食指觸摸前列腺，用以發現很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根 治的機會。但以上的方法都存在局限性。例如直腸指檢的局限性主要在4個方面：（1)患者 前列腺腫塊不大時，易漏診；（2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期，不易根治； (3)患者直腸有疾患時不能使用此檢測；（4)醫生經驗不足時可能有漏診或者誤診的可能。 正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng / ml)，當處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病 狀態時，PSA升高成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標，但其也存在一定局限性：（1)需要 取血檢測，對患者有一定的損傷；（2) PSA增高也常見與非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前 列腺肥大等，因此不易確診；（3) PSA增高確診前列腺癌時，往往患者已經屬于中后期，達不 到早期診斷的目的。前列腺超聲波檢測操作簡單直觀、無損傷，通過顯示腫塊的大小、數目、 位置、密度、邊緣、形體、有無鈣化及鈣化的形態、大小、數目、分布以及周圍的暈環、皮膚改 變等提供定位及定性征象并判斷病變的性質；其局限性是：（1)對致密性的小癌灶容易漏 診；（2)有時候不能提供明確的定性診斷；（3)因其不能顯示腫瘤的內部結構及周圍組織所 以診斷符合率很低；（4)對一些缺乏典型征象的實性良惡性腫塊有較高的誤診率。活組織 病理檢查因其創傷性、復雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標準，一般與 其他方法技術連用。
[0006] 近年來的研究表明，miRNA與前列腺癌密切相關，它們可能參與腫瘤的發生、發展 和轉移，所以對腫瘤的發病機制、早期診斷、個體化治療、轉移的檢測和預后等可能有相應 的作用。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種與前列腺癌相關的新的前列腺癌分子標志物，以及前 列腺癌診斷試劑盒，以及該前列腺癌分子標志物和前列腺癌診斷試劑盒在前列腺癌高危人 群篩選、診斷、治療及狀況監測、預后監測中的應用。
[0008] 本發明經研究發現MIR27A - 3P在前列腺癌組織樣本中的含量比前列腺正常組織 樣本中的含量低，顯示MIR27A - 3P與前列腺癌的腫瘤發生、發展存在著密切的相關性。因 此，本發明提出MIR27A - 3P作為與前列腺癌相關的新的前列腺癌分子標志物，并提供含有 該前列腺癌分子標志物MIR27A - 3P (作為標志物）的診斷試劑盒，以及該分子標志物或診 斷試劑盒在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療及狀況監測、預后監測中的應用。
[0009] 本發明提供的前列腺癌分子標志物MIR27A - 3P，是一種miRNA，其核苷酸序列為 SEQ ID NO. 1 所示。
[0010] 本發明提供含有前述前列腺癌分子標志物MIR27A - 3Ρ的診斷試劑盒。該診斷試 劑盒可用于前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預后監測等。
[0011] 前述的前列腺癌分子標志物MIR27A - 3Ρ作為標志物在制備前列腺癌尚危人群篩 選、診斷、治療狀況監測、預后監測的試劑盒中的應用，是通過檢測被試者組織樣本、血液和 尿液中的MIR27A - 3Ρ的含量，并與正常水平MIR27A - 3Ρ含量相比較，以進行前列腺癌高 危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預后監測。
[0012] 前述的前列腺癌分子標志物MIR27A - 3Ρ作為標志物在制備前列腺癌尚危人群篩 選、診斷、藥物設計、治療及狀況監測、預后監測的試劑盒中及藥物中的應用，可把被試者血 清、尿液和組織樣本中MIR27A - 3P的含量通過總RNA提取、反轉錄、定量PCR進行檢測。
[0013] 前述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒包括： (1)組織樣本、血液和尿液中總RNA提取試劑； 每50mg組織或200ul血液或200ul尿液，使用：
引物包括MIR27A - 3P和對照RNU6兩對引物； (4)前列腺正常組織cDNA (miR-27a反轉錄引物反轉錄） 作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應體系使用與檢測樣本cDNA 相同量。
[0014] 前述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒結果分析檢測樣本和陰性對照間比較采用t 檢驗，P〈0. 05為差異顯著，判為標本檢測陽性。
[0015] 前述檢測試劑盒所用對照為RNU6,其引物序列如下： RNU6 上游引物序列：5 ' -CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3 ' (SEQ ID N0. 2) RNU6 下游引物序列：5 ' -TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3 ' (SEQ ID N0. 3)。
[0016] 前述檢測試劑盒所檢測MIR27A - 3P，其引物序列如下： MIR27a - 3p 上游引物序列：5 ' -CTAATCGTGTTCACAGTGGCTAAG -3 ' (SEQ ID N0. 4) MIR27a - 3p 下游引物序列：5 ' -TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT -3 ' (SEQ