50] 圖14是表示實施例和比較例的培養基更換前后的球狀體的圖像的照片。
[0051] 圖15是表示實施例的回收了細胞的前后的圖像的照片。
[0052] 圖16是表示實施例的從培養容器回收了的球狀體的照片。
【具體實施方式】
[0053] 以下，參照附圖對實施方式進行說明。為了使說明明確化，對以下的記載和附圖進 行了適當省略和簡化。在各附圖中，對具有相同的結構或者功能的結構要素和相當部分標 注相同的附圖標記，并省略其說明。
[0054] 實施方式1.
[0055] (培養容器）
[0056] 圖1是表不一實施方式的培養容器的一例的圖。在圖1中不出了具有多個培養容 器1的培養板3的一部分。在圖1的上部示出了從培養板3的上方觀察形成于培養容器1 的底的多個凹陷10的一部分而得到的圖。培養容器1配置有多個凹陷10。從培養容器1 的制造、細胞培養的效率的觀點出發，優選的是，多個凹陷10規則地配置。培養容器1例如 相當于具有多個孔的孔板的一個孔。換言之，在孔板的各孔中配置有多個凹陷10。
[0057] 孔板是由帶有多個凹陷（洞或者孔）的平板構成的實驗?檢測器件，各孔被用作試 驗管或者淺底盤。孔的數量例如為6、24、96、384等，也可以是這些數量以上的數量。孔的 底除了是平坦的或者圓形的以外，也可以是由多個細長的微型管組合起來的形式的底（深 孔板）。
[0058] 另外，凹陷10因為形成作為用于培養細胞的微小的空間的微型空間，所以也能夠 被稱為微型容器。
[0059] 圖2、圖3是表不實施方式1的凹陷的形狀例的圖。圖2表不從橫向觀察一個凹陷 10時得到的剖視圖，圖3表示從上方觀察一個凹陷10時得到的圖。圖3所示的凹陷10是 圖1的上部的凹陷10的詳細結構例。
[0060] 各凹陷10由底部11和開口部12構成。底部11是構成培養容器1的底的部分， 開口部12是配置于底部11的上部的部分。將底部11和開口部12相接的部分記為交界。 在圖2中，附圖標記R的箭頭所示的長度部分與交界的位置相對應。另外，在圖3中，交界 的位置由雙點劃線表示。但是，底部11和開口部12由相連續的面構成，從而作為一體來制 造。
[0061] 在圖2、圖3中，對于形成于培養容器1的多個凹陷10而言，表示出等效直徑R、深 度（高度）D。
[0062] 等效直徑R是指與凹陷10的底部11內切的內切圓的直徑。在這里，是指在底部 11和開口部12的交界處內切的內切圓的直徑。更詳細而言，等效直徑R是指交界處的、與 凹陷10的高度Η的方向垂直的面的形狀的內切圓的直徑。
[0063] 深度D是從底部11的內側的底到凹陷10的上端的長度。凹陷10的上端與開口 部12的端部（上端）相同。深度D是凹陷10所形成的空間的深度。換言之，深度D是從 底部11所形成的空間的底到開口部12所形成的空間的上端的深度。在圖2中除了凹陷10 的深度D以外，還示出了底部11的深度D1和開口部12的深度D2。
[0064] 底部11形成用于培養細胞的空間（第1空間）。底部11例如具有半球狀的形狀。 例如，能夠使用將以等效直徑R為直徑的球形分為一半的形狀。底部11的形狀并不限定于 半球狀。其他的具體例在實施方式2中說明。
[0065] 開口部12形成以輔助細胞的培養和回收的方式起作用的空間（第2空間）。開口 部12由從與底部11之間的交界包圍到凹陷10的端部（頂端）的、錐角為1度以上20度 以下的壁構成。優選的是，構成開口部12的壁的錐角為5度以上且15度以下，更優選為10 度。其理由是：如果錐角過小，則在進行回收時細胞無法從凹陷轉移到培養基，相反地如果 錐角過大，則在培養基更換中細胞將會脫離。
[0066] 在圖2中，錐角由附圖標記Θ1、Θ2表示。在圖2、圖3所示的凹陷10的形狀例 中，示出了錐角Θ1、Θ2大致相同的情況。
[0067] 底部11和開口部12之間的交界以等效直徑R為50μm以上且1mm以下的方式形 成。在想要將營養供給到球狀體的中心部的情況下，優選等效直徑為50μm以上且500μm 以下，更優選等效直徑為100μm以上且500μm以下。其理由是：營養成分、氧只會通過擴 散而轉移到細胞內，中心部不壞死的等效直徑的大小被認為是300ym(EfremCurcioet al.，〃Masstransferandmetabolicreactionsinhepatocytespheroidsculturedin rotatingwallgas-permeablemembranesystem"，Biomaterials28(2007)5487-5497)， 為了不能達到該大小以上，優選上述直徑。
[0068] 相反，像癌細胞那樣，想要在細胞的中心部產生壞死的情況下 (FranziskaHirschhaeuseretal. ,^Multicellulartumorspheroids：An underestimatedtooliscatchingupagain"，JournalofBiotechnology 148 (2010) 3-15,Figl)，優選等效直徑R為400μm以上且不足2mm。其理由是：如上所述， 考慮到在等效直徑為300μπι時營養將會輸送到中心部而無法引起壞死的情況。因此，為了 獲得300μm以上的直徑的球狀體，等效直徑必須為400μm以上。
[0069] 此外，以從底部的底到端部的深度D為等效直徑R的0. 6倍以上且3倍以下的方 式形成。優選的是，深度D為等效直徑R0. 7倍以上且1. 2倍以下，更優選深度D為等效直 徑R的0. 8倍~1倍。
[0070] 另外，對于培養容器1，優選相鄰的兩個凹陷10之間是平坦的。例如，優選兩個凹 陷10的距離為從5μπι到50μπι的范圍。其理由是：為了高效地獲得大量的球狀體，優選 增加單位面積的球狀體數以進行高密度培養。因此，未形成球狀體的壁的上表面越小越好。 但是，在錐角很小的情況下如果壁較薄，則由于細胞接種時、培養基更換時的振動將有可能 容易產生龜裂。因此，優選兩個凹陷10的距離為5μπι以上。根據這樣的觀點，優選兩個凹 陷10的距離為5μm~20μm。
[0071] 與此相反，也可以是相鄰的兩個凹陷10相接觸。例如，可以是兩個凹陷10的端部 的一部分相接觸，并且開口部12的錐角的斜面相接觸而形成為山形的形狀。
[0072] 除上述形狀以外，培養容器1優選通過以下那樣的方式制造。
[0073] 培養容器1優選是由丙烯酸類樹脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯類樹脂、丙烯酸-苯 乙烯類共聚樹脂、聚碳酸酯類樹脂、聚酯類樹脂、聚乙烯醇類樹脂、乙烯-乙烯醇類共聚樹 月旨、熱塑性彈性體、氯乙烯類樹脂以及有機硅樹脂中的一種或者它們的組合形成的樹脂成 形品。
[0074] 優選的是，對于培養容器1所具有的各凹陷10,利用等離子體處理、玻璃涂覆、電 暈放電、UV臭氧處理中的任一種方法或者由這些方法組合而成的表面改性處理方法來形成 官能團，以水接觸角為45度以下的方式進行處理。
[0075] 此外，優選的是，向各凹陷10固定有用于阻礙細胞粘附的親水性的聚合物鏈。優 選的是，將親水性的聚合物鏈向以上述水接觸角為45度以下的方式處理過的各凹陷10固 定。
[0076] 此外，優選的是，向各凹陷10固定有磷脂或者磷脂?高分子復合物。更加優選的 是，該固定處理是針對上述那樣以水接觸角為45度以下的方式處理過的各凹陷10、固定有 親水性的聚合物鏈的各凹陷10或者將這些組合起來的各凹陷10來實施的。
[0077] 而且，優選的是，針對各凹陷10,利用等離子體處理、玻璃涂覆、電暈放電、UV臭氧 處理中的任一種方法或者由這些方法組合而成的表面改性處理方法來形成官能團，并以水 接觸角為45度以下的方式進行處理后，獲得固定有用于阻礙細胞粘附的親水性的聚合物 鏈以及磷脂或者磷脂?高分子復合物中的任一種聚合物的細胞非粘附表面。更加優選的是， 該處理與上述各處理、或者各處理的組合處理一起實施。
[0078] 另外，上述親水性的聚合物鏈優選為聚甲基丙烯酸羥乙酯，而且，更優選為聚甲基 丙烯酸羥乙酯的平均分子量為10萬以上。
[0079] (培養方法）
[0080] 接著，說明使用圖1至圖3所示的培養容器1的細胞的培養方法。
[0081] 細胞的培養按照以下各工序實施。
[0082] a)將分散有細胞的培養基添加至培養容器1的工序
[0083] b)培養細胞的工序
[0084] c)更換培養基的工序
[0085] d)使球狀體成長的工序
[0086] e)使球狀體在培養基中懸浮的工序
[0087]f)回收細胞的工序
[0088] 上述的各工序也能夠劃分為：從a)到d)是培養細胞的工序（細胞培養工序），e)、 f)是回收細胞的工序（細胞回收工序）。
[0089] 在這里，球狀體是由多個細胞聚集在一起而形成細胞塊且成為三維狀態的物體。
[0090] 以下說明各工序。
[0091] a)將分散有細胞的培養基添加至培養容器1的工序
[0092] 作為準備培養細胞的工序，將以下總數的細胞分散到培養基中，并將培養基添加 至培養容器1。
[0093] 總細胞數的下限是存在于培養容器1的凹陷10的數量（η)以上。
[0094] 總細胞數的上限是將培養容器1所具有的凹陷10的體積（V)除以所接種的細胞 的體積（ν)得到的數值乘以凹陷的數量（η)而得出的數量以下。用帶有符號的公式來表示 時，能夠表示為細胞總數的上限値=V/vXn。在這里，前提是多個凹陷10的體積（V)是相 同的。在體積不同的情況下使用平均值。
[0095] 培養基根據所培養的細胞進行調整。
[0096] b)培養細胞的工序
[0097] 在培養容器1內培養細胞12小時以上，并使細胞形成為球狀體。在向培養容器1 添加培養基時，分散到培養基的細胞進入凹陷10并在各凹陷10內培養。優選的是，一個細 胞分別進入各凹陷10中，而在底部11所形成的空間內形成一個球狀體。在各