培養容器和培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種細胞的培養以及細胞的回收的技術。
【背景技術】
[0002] 隨著近年來細胞工程學的發展，開發出模仿生物體內的細胞周圍環境、形態而獲 得具有更接近生物體內的機能的細胞的新的培養方法。利用這樣的方法培養出的細胞開始 嘗試著作為治療、生物體反應的模擬器來使用。開發出如下各種方法：使用由海綿、纖維等 構成的培養載體進行培養的方法、在培養基中使細胞懸浮而自然地形成球狀體的懸浮培養 以及在以往的培養容器（燒瓶等）中實施細胞非粘附處理而形成球狀體的方法等。特別 是球狀體培養是能夠維持細胞的相互作用的優秀方法，能夠應用于胰島細胞、肝細胞、干細 胞、癌細胞等各種各樣的細胞。近年來，進行了關注球狀體的大小的研究，例如在使用了癌 細胞的藥品篩選試驗中，將球狀體的直徑、體積作為指標（非專利文獻1)。另外，顯示出了 根據球狀體的大小而細胞所具有的機能不同的情況（非專利文獻2、3)。除了像這樣用于形 成球狀體的技術以外，控制球狀體的大小的技術開始受到關注。而且，因為能夠如此再現細 胞的特殊機能，所以期待在人工臟器、生物反應器等領域加以使用。在這樣的用途中，大量 地制作球狀體并進行回收的技術變得重要。
[0003] 作為制作直徑均等的球狀體的方法，在專利文獻1中，存在通過改變在具有設置 有親水性膜的U字底部的96WP中所接種的細胞數的個數來控制所形成的球狀體的大小的 方法。但是，單位培養面積的球狀體數的數量較少，難以制作大量的球狀體。作為其他方法， 在專利文獻2-4中公開一種在微型空間內形成球狀體的方法。
[0004] 專利文獻1 :日本特開平8-131153號公報
[0005] 專利文獻2 :日本特開2010-88347號公報
[0006] 專利文獻3 :國際公開第2012/036011號
[0007] 專利文獻4 :國際公開第2013/042360號
[0008] 非專利文獻 1:JuergenFriedrichl、他著、〃Spheroid-baseddrugscreen: considerationsandpracticalapproach"、PR0T0C0L、2009 年 2 月 12 日（Published online)pp. 309-324
[0009] 非專利文獻 2:FranziskaHirschhaeuser，他著、〃Multicellulartumor spheroids：Anunderestimatedtooliscatchingupagain〃、Journalof Biotechnology148、2010 年、pp. 3-15
[0010] 非專利文獻 3 :C'ELINELIUBAUWENS、他著、〃ControlofHumanEmbryonic StemCellColonyandAggregateSizeHeterogeneityInfluencesDifferentiation Trajectories"、STEMCELL、2008 年、pp. 2300-2310
【發明內容】
[0011] 發明要解決的問題
[0012] 然而，專利文獻1的培養方法的培養效率極低，成為進行大量培養時的瓶頸。另 外，專利文獻2、3的培養方法雖然單位面積的球狀體形成效率較高，但是在培養基更換時 球狀體有可能自空間內脫離。因此，需要在培養基更換時加以注意。而且，為了防止球狀體 的脫離，對使球狀體的一部分粘附在微型空間內的方法進行研討（專利文獻4)。但是，細胞 的粘附性因各種細胞而異，因此需要針對所使用的每個細胞研討表面處理方法，影響實用 性。
[0013] 本發明鑒于這樣的情況而做成，其目的在于提供一種培養容器和使用該培養容器 的培養方法，該培養容器能夠高效或者高效且大量地制造出大小均勻的球狀體，通過設計 能夠容易實施培養基更換和細胞回收的微型空間構造而具有所設計的微型空間構造。
[0014] 用于解決問題的方案
[0015] 本發明的一實施方式的培養容器的一技術方案為：該培養容器排列有具有底部和 開口部的多個凹陷。所述底部具有半球狀和圓錐臺狀中的任一種形狀，所述開口部由從與 所述底部的交界開始包圍到所述凹陷的端部的、錐角為1度以上且20度以下的壁構成。除 此以外，所述交界的等效直徑為50μm以上且2. 5mm以下，從所述底部的底到所述端部的深 度為所述等效直徑的〇. 6倍以上且3倍以下，構成所述開口部的壁形成有與所述底部相連 續的面，且所述相連續的面的傾斜在所述交界處發生變化。
[0016] 另外，在一實施方式的培養容器中，優選的是，所述端部的形狀為半球狀、梯形和 倒三角形中的任一種形狀，相鄰的兩個凹陷之間是平坦的，優選的是，所述兩個凹陷的距離 為 5μm~50μm〇
[0017] 而且，一實施方式的培養用的所述培養容器優選是由丙烯酸類樹脂、聚乳酸、聚乙 醇酸、苯乙烯類樹脂、丙烯酸-苯乙烯類共聚樹脂、聚碳酸酯類樹脂、聚酯類樹脂、聚乙烯醇 類樹脂、乙烯-乙烯醇類共聚樹脂、熱塑性彈性體、氯乙烯類樹脂以及有機硅樹脂中的一種 或者它們的組合構成的樹脂成形品。利用向所述凹陷實施的由等離子體處理、玻璃涂覆、電 暈放電、UV臭氧處理中的任一種方法或者這些方法組合而成的表面改性處理方法來形成官 能團，優選的是，以水接觸角為45度以下的方式進行處理。
[0018] 優選的是，向所述凹陷固定有用于阻礙細胞粘附的親水性的聚合物鏈。
[0019] 優選的是，向所述凹陷固定有磷脂或者磷脂?高分子復合物。
[0020] 優選的是，針對所述凹陷，利用等離子體處理、玻璃涂覆、電暈放電、UV臭氧處理中 的任一種方法或者由這些方法組合而成的表面改性處理方法來形成官能團，并以水接觸角 為45度以下的方式進行處理后，獲得固定有用于阻礙細胞粘附的親水性的聚合物鏈以及 磷脂或者磷脂?高分子復合物中的任一種聚合物的細胞非粘附表面。
[0021] 所述親水性的聚合物鏈優選為聚甲基丙烯酸羥乙酯，更加優選所述聚甲基丙烯酸 羥乙酯的平均分子量為10萬以上。
[0022] 本發明的一實施方式的培養方法的一技術方案為使用上述任一種培養容器。而 且，在該培養方法中，使總細胞數為所述培養容器所具有的所述凹陷的數量（N)以上、且為 將所述凹陷所形成的空間的體積（VI)除以所接種的細胞的體積（V2)得到的數值乘以所述 凹陷的數量（N)而得出的數量以下的細胞分散到培養基，并將所述培養基添加到所述培養 容器。
[0023] 本發明的一實施方式的培養方法的一技術方案為優選使所述凹陷所形成的每個 空間形成有一個球狀體，更優選在所述空間形成球狀體且使球狀體成長（增殖）。
[0024] 在對球狀體進行分化誘導的情況下，優選的是，在使球狀體形成于所述空間的狀 態下進行誘導。
[0025] 優選的是，形成于所述培養容器內的球狀體的總數的60%以上的直徑是在平均球 狀體直徑的正負5%的范圍內的直徑。
[0026] 優選的是，通過攪拌所述培養基來回收所述凹陷內的細胞，所述培養基的攪拌的 方法為如下方法中的任一種方法：通過振蕩所述培養容器來攪拌所述培養基的方法、通過 吸引和排出所述培養基來攪拌所述培養基的方法、通過在所述培養容器中設置攪拌葉片來 攪拌培養基的方法、通過將攪拌棒放入所述培養容器來攪拌培養基的方法、或者將這些方 法組合而成的方法。
[0027] 優選的是，至少對所述培養基進行1次以上更換，并且所更換的培養基的比例為 20%以上。
[0028] 本發明的一實施方式的培養方法的另一技術方案為使用上述任一種培養容器。而 且，培養方法通過實施以下的各工序來進行細胞的接種、細胞的培養、培養基的更換以及細 胞的回收。
[0029] a)使存在于所述培養容器的凹陷的數量（N)以上且在將所述凹陷的體積（VI)除 以所接種的細胞的體積（V2)得到的數值乘以所述凹陷的數量（N)而得出的數量以下的細 胞數分散到培養基，并將所述培養基添加到所述培養容器的工序；
[0030] b)在所述培養容器內培養所述細胞12小時以上并使所述細胞形成為球狀體的工 序；
[0031] c)吸引20%以上的所述培養基之后注入同量的新鮮培養基的工序；
[0032] d)重復數次所述a)至c)的工序以使球狀體成長的工序；
[0033] e)在使所述球狀體成長到所希望的大小之后攪拌所述培養基以使各凹陷內的細 胞懸浮在所述培養基中的工序；以及
[0034] f)利用吸引機針對每個所述培養基吸取所述細胞來回收所述細胞的工序。
[0035] 發明的效果
[0036] 采用本發明，能夠提供一種培養容器和使用該培養容器的培養方法，該培養容器 在能夠高效且大量地制造出大小均勻的球狀體的基礎上、通過設計能夠容易實施培養基更 換和細胞回收的微型空間構造而具有所設計的微型空間構造。
【附圖說明】
[0037] 圖1是表不一實施方式的培養容器的一例的圖。
[0038] 圖2是表示從橫向觀察實施方式1的凹陷而得到的形狀例的剖視圖。
[0039] 圖3是表示從上方觀察實施方式1的凹陷而得到的形狀例的圖。
[0040] 圖4是表示實施方式2的使用球形狀的一部分的凹陷的形狀例的圖。
[0041] 圖5是表示實施方式2的使用球形狀的一部分的凹陷的其他形狀例的圖。
[0042] 圖6是表示實施方式2的使用圓錐臺的凹陷的形狀例的圖。
[0043] 圖7是表示實施方式2的凹陷的其他形狀例的圖。
[0044] 圖8是表示實施方式3的開口部的形狀例的圖。
[0045] 圖9是表示實施方式3的開口部的其他形狀例的圖。
[0046] 圖10是表示實施方式4的培養容器的結構例的圖。
[0047] 圖11是表不實施方式4的另一培養容器的結構例的圖。
[0048] 圖12是表不實施方式4的又一培養容器的結構例的圖。
[0049] 圖13是表示實施例和比較例的培養基更換時的球狀體的殘存率的圖。
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