0Ji1 反應體系：10Ji1SsoAdvanceSYBRMastermix, 5Ji1cDNA，200nM引物， 剩余體積用無菌水補齊至20Ji1。mcpM基因擴增引物為mcpM-F和mcpM-R(引物序列見表 1)內(nèi)參基因巧OD擴增引物為巧OD-F和巧OD-R;反應程序為：95°C預變性2分鐘，95°C變 性15秒，55 °C延伸1分鐘，40個循環(huán)；從75 °C開始讀板，每個循環(huán)增加0. 5 °C制備溶解曲線。 相對表達量的計算方法參照Livak的2 。
[003引 巧）、結果分析：在接種至M9和LB兩種培養(yǎng)基之前是在LB中生長24小時的培養(yǎng) 物，因此選取此培養(yǎng)物為參照。如圖1所示，經(jīng)4小時和8小時培養(yǎng)后，mcpM基因的表達量 在M9培養(yǎng)基中明顯高于在LB培養(yǎng)基中的表達量，尤其是在8小時后，前者約是后者的20 倍。相對于LB，M9是寡營養(yǎng)、低滲透壓培養(yǎng)基，因此推測mcpM基因的表達受到低滲透壓的 誘導，其上游可能存在一個受滲透壓調(diào)節(jié)的啟動子。
[003引表1引物序列表
[003引實施例2:啟動子PmccPDI受滲透壓調(diào)控的鑒定：
[0039] 在實施例1的基礎上，通過如下步驟對啟動子PmeePDI進行鑒定，具體如下：
[0040](1)、大腸桿菌E25基因組DNA制備：取過夜培養(yǎng)的E25培養(yǎng)物100yL離心細菌 沉淀重懸在200yL無菌TE溶液（IOmMTris-HCl,ImM邸TA,pH8. 0)，沸水煮lOmin，冷卻 至室溫，充分震蕩IOs后120(K)r/min離屯、2min，上清液即為大腸桿菌E25基因組DNA，置 于-20°C備用；
[0041](2)、PmeePDI啟動子序列的獲得及純化：根據(jù)mCCPDI基因簇序列（登錄號： JQ901381)設計一對引物PmeePDI-F/PmeePDI-R，W上述基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反 應使用Invitrogen公司的PlatinumPCRSuperMixHi曲Fidelity試劑盒，反應體系和反 應條件按照試劑盒說明書進行。反應結束后對擴增產(chǎn)物使用QIAGEN公司的PCR純化試劑 盒進行，DNA濃度使用Nano化op?2000分光光度計完成。
[0042] (3)、滲透壓調(diào)控蛋白OmpR的表達、純化：OmpR是滲透壓調(diào)控蛋白，通常會結合到 滲透壓調(diào)節(jié)的啟動子序列上。為驗證Pm。。。。;是否受滲透壓調(diào)控，通過常規(guī)的原核表達在體外 獲得了OmpR蛋白，用于下述的凝聚阻滯實驗。
[0043] (4)、凝聚阻滯實驗（EMSA):將純化的啟動子DNA序列與不同濃度OmpR蛋白 (0,75，150,300,600,900ng)分別在結合緩沖液[lOmMTris(pH7.5)，100mMKCl，10mM MgC12,ImMDTT，5%glycerol]中室溫解育30分鐘，然后加入電泳緩沖液在5%非變性TBE 膠100伏電泳45分鐘，用邸染色拍照。
[0044]巧）、EMSA結果分析：如圖2 (A)所示，在OmpR存在情況下，啟動子DNA電泳被阻滯， 在靠近點樣孔的出現(xiàn)出現(xiàn)蛋白質(zhì)-核酸復合物，尤其是隨著OmpR蛋白濃度的增加巧OOng), 所有的啟動子DNA電泳被阻滯，蛋白質(zhì)-核酸復合物出現(xiàn)在更大的位置。運說明PmttPDI啟動 子序列存在OmpR結合的位點，是受滲透壓調(diào)控的啟動子。
[004引做、PmeePDI啟動子序列中OmpR結合位點分析：將PmeePDI啟動子序列與OmpF和OmpC 的啟動子序列進行多重序列比對，結果如圖2度)，P"_PDI啟動子序列至少存在3個OmpR結合 位點，含有保守的且必須的核巧酸位點，運進一步證實PmeePDI啟動子是受滲透壓調(diào)控的啟動 子。
[004引實施例3:含有啟動子PmeePDI的重組載體構建：
[0047] 本發(fā)明待表達外源基因W綠色巧光蛋白（GF巧基因為例，采用重疊延伸PCR法將 其連接到啟動子Pm。。。。;下游；構建含有啟動子P和GFP基因的重組表達載體，主要步驟 如下：
[004引 （1)、引物設計：W啟動子PmeePDI序列和GFP基因序列為模板，使用PrimerPremier 5軟件設計兩對引物，分別為PmccPDi-F/PmccPDi-SOE-R和GFP-SOE-F/GFP-R，用于下述的重疊 延伸PCR反應。
[0049] (2)、重疊延伸PCR法：重疊延伸PCR法包含兩輪PCR反應，第一輪PCR使用 PmccPDi-F/PmccPDi-SOE-RW實施例2中大腸桿菌E25基因組DNA為模板進行PCR擴增啟動子 PmccPDi，同時使用GFP-SOE-F/GFP-RW祀GFP-N3質(zhì)粒（帶有GFP基因）為模板進行PCR擴 增GFP基因。第二輪PCRW第一輪PCR擴增的產(chǎn)物為模板，使用P"_pdi-F/GFP-R進行擴增。 PCR反應使用Invitrogen公司的PlatinumPCRSuperMixHi曲Fidelity試劑盒，反應體 系和反應條件按照試劑盒說明書進行。第二輪PCR擴增產(chǎn)物為PmttPDI-GFP融合片段，使用 QIAGEN公司的PCR純化試劑盒進行對擴增產(chǎn)物進行純化，DNA濃度使用Nano化op?2000分 光光度計完成。
[0050](3)、將純化后的PmeePDI-GFP融合片段連接到pCR2. 1載體上（購買自Invitrogen 公司），DNA片段和載體的比例等按照說明書進行；使用熱激法將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌 TOPlO感受態(tài)中，最后通過菌落PCR篩選陽性克隆。
[0051](4)、重組載體驗證：使用QIAGEN公司的質(zhì)粒制備試劑盒（QIAprepSpinMiniprep Kit)從陽性克隆中提取重組載體pCR2. 1-P"_pdi-GFP，送至上海生物工程公司測序驗證。[005引實施例4:啟動子P 驅動外源基因在大腸桿菌體系中表達的應用：
[0053] 本發(fā)明驅動的外源基因W綠色巧光蛋白（GF巧基因為例，說明啟動子PmttPDI驅動 外源基因在大腸桿菌體系中表達，具體步驟如下：
[0054] (1)、將在實施例3中測序驗證正確的重組載體轉化至大腸桿菌基因工程菌株 TOPlO中，在含有氨節(jié)青霉素的LB中培養(yǎng)過夜，分別W1 :100接種至新鮮的LB和M9兩種 不同滲透壓的培養(yǎng)基，置于37°C搖床20化pm震蕩培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基配方與實施 例1中相同。
[00巧](2)、巧光觀察GFP表達：培養(yǎng)8小時后，分別取Iml培養(yǎng)物1200化pm離屯、2min， 細菌沉淀重懸于含0. 5yg/mlDAPI的PBS中室溫避光解育IOmin;然后將細菌懸液轉移至 多聚賴氨酸處理后的載玻片上，使細菌自然吸附到載玻片上，輕輕使用PBS細菌未吸附的 細菌后，蓋玻片封片。
[005引啟動子PmccPD在低滲透壓啟動GFP基因表達：巧光顯微觀察顯示結果如圖3所示， 攜帶重組質(zhì)粒pCR2.I-PmeePDI-GFP的TOPlO菌株在M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)有明顯的綠色巧光，而在 LB培養(yǎng)基中未觀察綠色巧光，運說明在低滲透壓培養(yǎng)基中啟動子PmttPDI發(fā)揮功能，能啟動外 源基因的表達。
[0057] W上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限 審Ij，凡熟悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明技術方案范圍內(nèi)，當可利用W上所掲示的技 術內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依 據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術對W上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本 發(fā)明的技術方案的范圍內(nèi)。
【主權項】
1. 一種受滲透壓調(diào)控的啟動子P 其特征在于：所述啟動子P_PDI來源于大腸桿菌 SSuT-25菌株，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種受滲透壓調(diào)控的啟動子P_PDI，其特征在于：所述啟動子 PmccPDi在體外能與滲透壓調(diào)節(jié)蛋白OmpR相結合，擁有至少3個潛在的OmpR結合位點。3. -種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含權利要求1或2所述的受滲 透壓調(diào)控的啟動子P_PDI;在重組表達載體中，啟動子P_PDI連接于外源基因序列的上游。4. 根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述的外源基因為綠色熒光蛋 白基因或其他待表達外源基因。5. 根據(jù)權利要求3或4所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體為 pCR2. l-Pmc(：pDI-GFP〇6. 權利要求1或2所述的受滲透壓調(diào)控的啟動子P_PDI在驅動外源基因表達中的應用。7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于：所述外源基因為綠色熒光蛋白基因。8. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于：將包含權利要求1或2所述的受滲透壓 調(diào)控的啟動子P_PDI的重組表達載體PCR2. 1-P _pdi-GFP轉化到大腸桿菌基因工程T0P10菌 株中，在M9培養(yǎng)基中誘導GFP基因的表達，表明低滲透壓誘導條件下啟動子P_ PDI能驅動目 標基因在大腸桿菌體系中的尚效表達。
【專利摘要】本發(fā)明一種受滲透壓調(diào)控的啟動子PmccPDI、其重組表達載體及應用，屬于基因工程領域。所述啟動子PmccPDI序列如SEQ？ID？NO.1所示，來源于大腸桿菌SSuT-25菌株；該啟動子在體外能與滲透壓調(diào)節(jié)蛋白OmpR相結合，擁有至少3個潛在的OmpR結合位點。本發(fā)明還提供了含有該啟動子以及GFP基因的重組表達載體，將該重組表達載體轉化到大腸桿菌基因工程TOP10菌株中，在M9培養(yǎng)基中能誘導GFP基因的表達。本發(fā)明的啟動子具有可以不依賴于IPTG等化學試劑誘導實現(xiàn)外源基因在大腸桿菌表達體系中高效表達，成本低，對表達產(chǎn)物不產(chǎn)影響；有利于表達產(chǎn)物尤其是分泌性表達蛋白的后續(xù)純化和活性分析的優(yōu)點。
【IPC分類】C12N15/113, C12N15/70, C12N1/21, C12R1/19
【公開號】CN105296489
【申請?zhí)枴緾N201510875053
【發(fā)明人】趙哲, 胡超群, 任春華, 江曉, 鄧益琴
【申請人】中國科學院南海海洋研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年12月2日