、其重組表達載體及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，具體設及一種受滲透壓調控的啟動子Pm。。。。;、其重組表 達載體及應用，該啟動子能夠在大腸桿菌基因工程菌株中在低滲透壓環境中驅動外源基因 的高效表達。
【背景技術】
[0002] 啟動子是一段位于基因5'端上游的DNA序列，基因的一個重要組成部分，通過與 RNA聚合酶或其他轉錄因子等反式作用元件特異結合，控制著基因表達。啟動子一般分為組 織特異啟動子、組成型啟動子和誘導型啟動子3類。組織特異啟動子又稱為器官特異性啟 動子，在運類啟動子調控下基因只在某些特定的器官或組織中表達，通常表現出發育調節 的特性。組成型啟動子則與組織特異啟動子不同，調控表達目的基因在不同組織、部位中表 達水平沒有明顯差異，不具有時間和空間特異性。誘導型啟動子在某些特定的物理或化學 信號的刺激下，可W大幅度地提高基因的轉錄水平和表達量，因此運類啟動子具有與誘導 因子特異結合的順式作用元件。
[0003] 大腸桿菌作為現代基因工程最為常用的原核表達系統，其核屯、為基因啟動元件的 高效性、可控性W及誘導表達后對下游工藝不產生影響。誘導性啟動子在大腸桿菌表達系 統中具有廣闊的應用前景，尤其是人工構建的誘導型啟動子，如：在大腸桿菌表達系統中最 為常見的T7啟動子、tac啟動子和地AD啟動子等。但是運類啟動子需要加入IPTG等化學 藥物進行誘導，在此過程中運些化學藥物存在一定毒性，尤其在制備醫學使用的重組蛋白 并不合適；此外，在進行大規模發酵時大量加入IPTG成本高昂，而且會對后期的純化W及 生物藥物的應用帶來諸多麻煩。因此為了獲得不依賴IPTG等化學因子誘導的新型啟動子， 開始發掘和分離天然誘導性啟動子，如溫度誘導型啟動子、抑誘導型啟動子和光誘導型啟 動子等。不過通過光和溫度誘導控制會耗費大量的能源，而且由于升溫時間漫長，找出誘導 效果不顯著。抑誘導控制雖然節省，但是對于某些蛋白尤其是分泌性蛋白來說，在酸性或堿 性條件下失去活性或功能。尋找一種不依賴于IPTG等化學因子W及溫度等誘導的新型啟 動子將具有重要意義。
【發明內容】
[0004] 本發明從大腸桿菌SSuT-25中發現、鑒定一個受滲透壓調控的啟動子，并將該啟 動子進行應用。首先，通過巧光定量PCR分析發現大腸桿菌SSuT-25編碼的微型細菌素 mccPDI基因簇在低滲透壓培養基M9中表達量明顯高于高滲透壓培養基LB中的表達量，說 明可能受到滲透壓調控；其次在mccPDI基因簇上游分離到200bp序列，序列分析其具有滲 透壓調控元件，被命名為PmeePDI;將其插入到報告基因綠色巧光蛋白GFP上游，構建表達載 體，并轉入基因工程菌株大腸桿菌TOPlO中，巧光顯微鏡觀察顯示綠色巧光蛋白GFP在M9 培養的細菌中高水平表達，而在LB培養的細菌中未觀察到表達，說明PmttPDI是低滲透壓誘 導表達的啟動子。將該啟動子應用于外源基因的規模化表達，不僅可W節省成本，而且在表 達分泌性的蛋白時，含該啟動子的表達系統有利于目的蛋白的純化和應用，在實際生產中 具有重要價值。
[0005] 本發明的目的在于公開了
[0006] 本發明的目的是通過W下技術方案實現的：
[0007] -種受滲透壓調控的啟動子Pm。。。。;，其中，所述啟動子Pm。。?;來源于大腸桿菌 SSuT-25菌株，其DNA序列如沈QIDNO. 1所示。
[0008] 上述技術方案所述的一種受滲透壓調控的啟動子P"_PDi，其中，所述啟動子Pm。。?; 在體外能與滲透壓調節蛋白OmpR相結合，擁有至少3個潛在的OmpR結合位點。
[0009] 一種重組表達載體，其中，所述重組表達載體包含上述技術方案所述的受滲透壓 調控的啟動子Pm。。。。;;在重組表達載體中，啟動子Pm。。?;連接于外源基因序列的上游。
[0010] 上述技術方案所述的重組表達載體，其中，所述的外源基因為綠色巧光蛋白（GFP) 基因。
[0011] 上述技術方案所述的重組表達載體，其中，所述重組表達載體為 PCR2.l-PmeePDI-GFP。
[0012] 上述技術方案所述的受滲透壓調控的啟動子Pm。。。。;在驅動外源基因表達中的應 用。
[0013] 上述技術方案所述的應用，其中，所述外源基因為綠色巧光蛋白基因或其他待表 達外源基因。
[0014] 上述技術方案所述的應用，其中，將包含上述技術方案所述的受滲透壓調控的啟 動子PmeePDI的重組表達載體PCR2.I-PmeePDI-GFP轉化到大腸桿菌基因工程TOPlO菌株中，在 M9培養基中誘導GFP基因的表達，表明低滲透壓誘導條件下啟動子PmttPDI能驅動目標基因 在大腸桿菌體系中的高效表達。
[0015] 本發明的目的在于提供了一種受滲透壓調控的啟動子及其應用，在低滲透壓環境 中該啟動子能驅動下游外源基因的高效表達。
[0016] 為實現上述發明目的，本發明提供一種受滲透壓調控的啟動子PmeePDI，該啟動子 具有序列表SEQIDNO: 1所示的堿基序列，來源于大腸桿菌SSuT-25編碼的微型細菌素 mccPDI的啟動子。
[0017] 本發明還提供了一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的受滲透壓調控 的啟動子Pm。。?;，待表達的綠色巧光蛋白（GF巧基因連接于啟動子的下游，所述重組表達載 體命名為pCR2. 1-P"_pdi-GFP。其他待表達外源基因連接到啟動子P"_PDI下游構建的表達載 體也在本發明的保護范圍。
[001引本發明還提供了所述啟動子PmeePDI在驅動綠色巧光蛋白（GFP)基因表達中的應 用。將上述所提供的重組表達載體轉化到大腸桿菌TOPlO中，在低滲透壓培養基中培養誘 導GFP基因的表達，實現外源基因在啟動子PmttPDI驅動下在大腸桿菌體系中表達應用。
[0019] 根據本發明實施例的內容，其他待表達外源基因連接到啟動子Pm。。。。;下游構建的 表達載體也在本發明的保護范圍。
[0020] 本發明具有W下有益效果：
[0021] 1、發現一種天然的受滲透壓調控的啟動子，可W不依賴于IPTG等化學試劑誘導 實現外源基因在大腸桿菌表達體系中高效表達，成本低，對表達產物不產影響。
[0022] 2、因為該啟動子是在M9低滲透壓培養基啟動下游基因表達，M9培養基成分簡單、 已知；利用該啟動子構建的表達系統在M9中進行規模化表達后，有利于表達產物的后續純 化和活性分析，尤其是對分泌性表達蛋白。
【附圖說明】
[0023] 1、圖1為實施例1中巧光定量PCR分析mcpM基因在M9和LB兩種培養基中的表 達情況。
[0024]2、圖2為實施例2中鑒定啟動子PmeePD沒滲透壓調控的結果圖，其中（A)圖為凝 膠阻滯實驗，OmpR通過原核表達純化獲得的蛋白，XRE為其他蛋白作為陰性對照，其表達和 純化條件與OmpR相同；其中度）是啟動子P"_pDi序列中含有的S個可能的OmpR結合位點 度1，B2,B3)，W及與OmpF啟動子序列中（F1，F2,F3)、OmpC啟動子（Cl)OmpR結合位點的多 重比對圖。
[002引 3、圖3為實施例4中啟動子P"_pDi驅動綠色巧光蛋白基因在大腸桿菌體系中表達 圖，其中（A)和度）是攜帶pCR2.I-PmeePDI-GFP重組質粒的大腸桿菌TOPlO在M9培養基中生 長8小時后的巧光顯微觀察圖，（C)和值）是同一菌株在LB培養基中生長8小時后的巧光 顯微觀察圖；其中（A)和（C)中的巧光表示DAPI染色的細菌核酸，（C)中巧光為表達的綠 色欠光蛋白。
【具體實施方式】：
[0026] 為使本發明的技術方案便于理解，W下結合具體試驗例對本發明一種受滲透壓調 控的啟動子Pm。。。。;、其重組表達載體及應用作進一步的說明。
[0027] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法或者按照試劑盒說明書 進行；下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到；所用引物 合成和測序工作均由上海生物工程有限公司完成。
[002引連施例1:受滲歲壓調控的啟動子PmeePDI發現：
[0029]mccPDI是大腸桿菌SSUT25菌株編碼的一種微型微型細菌素，其編碼基因為mcpM。 本發明發現mcpM基因的表達與所使用培養基（M9vsLB)有關，預示著mcpM基因的啟動子 (PmccPDI)可能受到滲透壓的調控。具體的發現過程如下：
[0030](1)、大腸桿菌SSUT25在兩種不同培養基中的培養：大腸桿菌SSuT25(E25)來源于 美國華盛頓州立大學Douglas化11實驗室。將在LB中過夜培養的E25分別W1:100接種 至新鮮的LB和M9兩種不同滲透壓的培養基，置于37°C搖床20化pm震蕩培養。
[0031]LB培養基配方：10g/L膜蛋白腺，5g/L酵母抽提物，lOg/L氯化鋼，其中膜蛋白腺和 酵母抽提物購買抓公司；M9培養基配方：憐酸氨二鋼6g/l，憐酸二氨鐘3g/l，氯化鋼0. 5g/ 1，氯化錠1邑/1，維生素812111邑/1，硫酸儀11111，氯化巧0.11111和0.2%葡萄糖。
[003引似、細菌RNA提取：在培養4小時和8小時分別收樣，取1~1. 5ml細菌培養物， 通過1000化pm離屯、收集菌體，并重懸于350JilRNAwiz (Ambion公司產品）；在LB中培 養24小時的培養物作為對照；每組樣品隨后RNA提取使用Ambion公司的細菌RNA提取試 劑盒度acteria Ribopure kit)進行完成，操作步驟嚴格按照說明書進行。RNA定量使用 Nano化op?2000分光光度計完成。
[0033](3)、cDNA合成：cDNA合成使用BioRad公司的iScriptSupmix完成，20yI反應 體系中使用5(K)ngRNA，操作步驟按照說明書進行。產生的CDNA稀釋10倍后用于巧光定量 PCR。
[0034](4)、巧光定量PCR:PCR反應使用BioRad公司的2倍濃縮SsoAdvanceSYBR Mastermix, 2