0)中；每200頭雌性白蛾周氏曬小 蜂的觸角膽存于一個1. 5mL離屯、管中，共捜集8管樣品，并于-20°C下低溫保存，樣品制備 完成后送華大基因科技服務有限公司化ttp://www.genomics,cn/index)進行轉(zhuǎn)錄組測序。 [0020] 應用高通量測序平臺IlluminaHiSeqTM2000對周氏曬小蜂觸角樣本進行轉(zhuǎn)錄組 測序，采用Trinity軟件對每個讀取序列片段進行聚類后拼接成unigene，再結(jié)合生物信 息學軟件進行祀標序列CDNA全長的判定，進行Blast同源序列檢索予W確認，得到化p70 基因cDNA序列和編碼氨基酸的序列。
[0021] 實施例2: 總RNA的提取 選取30頭左右白蛾周氏曬小蜂進行不同溫度處理，高溫處理（Ih)為28°C、32°C、36°C、 4〇°c和42°c;低溫處理（比）為irc、6°c、rc、-3°C、-7°C。處理后產(chǎn)物立即使用或保存 于-20°C冷凍。
[002引（1)取30頭左右白蛾周氏曬小蜂置于1. 5血的無菌離屯、管內(nèi)，倒入液氮并迅速用 研磨棒進行充分研磨。將600yLTrizon溶液加入離屯、管，靜置5min。
[002引 （2)將200yL氯仿加入離屯、管，劇烈振蕩15s，靜置3min。
[0024] (3) 4°C下1200化pm離屯、15min，將上層無色水相轉(zhuǎn)入新無菌離屯、管中，加入 400yL異丙醇，-20°C下放置 20min，12000巧m離屯、lOmin。
[00巧](4)小屯、倒掉管中液體，保留沉淀，加入600yL75%乙醇洗涂沉淀。4°C下7500巧m離屯、5min，再重復一次乙醇洗涂沉淀操作。
[0026] (5)小屯、棄去上清液，室溫干燥2min。將RNA沉淀溶于20yLRelutionBuffer中， 必要時可55°C-60°C水浴IOmin。
[0027] (6)所得沉淀即為白蛾周氏曬小峰總RNA，產(chǎn)物立即使用或冷凍保存于-70°C。
[002引 實施例3 : cDNA的合成 W實施例2所述白蛾周氏曬小蜂總RNA作為模板。取一消毒的0.2mL離屯、管，加入W下反應體系（20JiL體系）：TotalRNA5JiL,orRandomPrimer(N9) (0.1Hg/JiDlyL， 2XTS Reaction Mix 10jiL，TransSc;ript?RT/RI Enzyme Mix ljiL，RNase-free Water3yL，混勻。
[0029] 反應條件為25°C水浴保溫10分鐘，42°C水浴保溫30分鐘，85°C高溫加熱5分鐘， W使離屯、管中存留的化ansScript?RT失去活性。產(chǎn)物立即使用或保存于-20°C冷凍。
[0030] 實施例4 : 巧光定量PCR反應體系和條件 (1) 引物設計： 根據(jù)所述周氏曬小蜂化p70基因的全長序列，使用Primer5軟件設計適用于實時巧 光PCR檢測的特異性引物，引物序列如下： Hsp70-F:5' -GACTTGGGCACCACATACT-3' Hsp70-R:5'-GTCCGTGAAGGCAACATAG-3' PCR產(chǎn)物預計長度為110bp 同時，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫里提供的周氏曬小蜂GADPH基因的Cds序列設計用于實時巧 光PCR內(nèi)對照的引物，引物序列如下： GADPH-F:5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3' GADPH-R：5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3' PCR產(chǎn)物預計長度為154bp (2) 實時巧光PCR:運用SYBRGreen嵌合巧光法進行RT-PCR分析。使用CF96XPCR儀 (Bio-Rad)進行PCR反應。W上述實施例3中合成的CDNA為模板，使用Hsp70-F和Hsp70-R、 GADPH-F和GADPH-R為特異性引物，進行實時巧光PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴 增后所得3個平行管的Ct值(即每個反應管內(nèi)的巧光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的反應 循環(huán)數(shù)）取平均數(shù)。
[0031] 實時巧光PCR擴增體系設置如下：
實時巧光PCR擴增參數(shù)設置如下： 50°C 120s； 95°C 120s ;95°C Is ;60°C 30s (40個循環(huán)）； (3)白蛾周氏曬小蜂在不同溫度下Hsp70基因相對表達量計算： 當目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率相近時，采用廠&&ET法計算各個溫度下化p7〇基因 相對于內(nèi)參基因的的mRNA相對表達量，用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，Duncan 氏新復極差法檢驗不同處理間差異顯著性。
[0032] 圖I為不同溫度下周氏曬小蜂Hsp70基因的相對表達量。從圖中看出無論是高溫 還是低溫都可W影響周氏曬小蜂體內(nèi)的Hsp70的表達。在低溫脅迫的情況下，隨著溫度的 不斷降低，周氏曬小蜂體內(nèi)的Hsp70的相對表達量呈上升的趨勢，并且在-7°C時達到最大 表達量；在高溫脅迫的情況下，隨著溫度的不斷升高，周氏曬小峰體內(nèi)的Hsp70的相對表達 量也呈上升的趨勢，但在40°C時達到最大表達量。運對于W后在何種室外溫度下放飛白蛾 周氏曬小蜂防治美國白蛾具有重要意義。
【主權項】
1. 一種采用熒光RT-PCR技術檢測周氏嚙小蜂Hsp70基因表達的特異性引物，其特征在 于它是由符合熒光PCR反應特點的特異性上下游引物： Hsp70-F:5'-GACTTGGGCACCACATACT-3' ；Hsp70-R:5'-GTCCGTGAAGGCAACATAG-3'。2. -種采用權利要求1所述的特異性引物快速檢測周氏嚙小蜂Hsp70基因表達的方 法，其特征在于按如下步驟進行： 使用下述引物進行該基因的檢測： 符合熒光PCR反應特點的該序列特異上下游引物： Hsp70-F:5' -GACTTGGGCACCACATACT-3' Hsp70-R:5'-GTCCGTGAAGGCAACATAG-3' (2) 總RNA的提?。翰捎酶鞣N通用的RNA提取方法，從周氏嚙小蜂成體中提取總RNA; (3)cDNA合成：以周氏嚙小蜂總RNA為模板合成cDNA，反應體系為20μL; (4) 實時熒光PCR:以上述合成的cDNA為模板，上述（1)中Hsp70-F和Hsp70-R、GADPH-F 和GADPH-R為特異性引物，進行實時熒光PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴增后所 得3個平行管的Ct值取平均數(shù)； (5) 周氏嚙小蜂在不同溫度下Hsp70基因相對表達量計算： 實時熒光PCR后，當目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率相近時，采用ΛΛCT法計算不同 溫度下Hsp70基因相對于內(nèi)參GADPH基因的mRΝΑ相對表達量。3. 權利要求1所述快速檢測周氏嚙小蜂Hsp70基因表達的方法，其中每條引物分別配 制成濃度為25ymol/L的貯存液，工作濃度為0.5ym〇l/L〇4. 權利要求1所述的采用熒光RT-PCR技術檢測周氏嚙小蜂Hsp70基因表達的特異性 在制備檢測周氏嚙小蜂適應外界環(huán)境變化方面的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用熒光RT-PCR技術檢測周氏嚙小蜂Hsp70相對表達量的方法。本發(fā)明中周氏嚙小蜂Hsp70實時熒光RT-PCR檢測方法的建立，為研究周氏嚙小蜂Hsp70表達調(diào)控機理及其生態(tài)防治奠定基礎。研究溫度的變化對于周氏嚙小蜂體內(nèi)Hsp70基因表達量的影響，研究結(jié)果可為科學利用天敵昆蟲周氏嚙小蜂提供理論基礎，這對于以后在何種室外溫度下放飛周氏嚙小蜂防治美國白蛾具有重要意義。本發(fā)明為在mRNA水平對Hsp70基因的相對定量分析提供了技術平臺。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105296480
【申請?zhí)枴緾N201510838241
【發(fā)明人】李敏, 王鳳竹, 張新玥, 李婷婷, 朱耿平, 劉強
【申請人】天津師范大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月26日