采用熒光RT-PCR技術檢測周氏嚙小蜂Hsp70基因表達的方法
【專利說明】采用巧光RT-PCR技術檢測周氏曬小蜂Hsp70基因表達的方 法
[0001] 本發明得到：國家自然科學基金（31201730);天津市高等學校科技發展計劃項目 (20110602);天津師范大學博±基金（52XB1003)及天津市動植物抗性重點實驗室開放基金 的資助。
技術領域
[0002] 本發明設及生物技術領域，設及用于檢測周氏曬小蜂化p70基因表達的特異性引 物，更具體的說是一種采用巧光RT-PCR技術檢測周氏曬小蜂化p70基因表達的方法。主要 用于周氏曬小蜂化p70基因表達調控機理及其生態防治的研究，研究結果可為科學利用天 敵昆蟲周氏曬小蜂進行生物防治提供理論基礎。
【背景技術】
[0003] 熱激蛋白化at shock protein化sp)是一類在生物體內廣泛存在的，對體內外 環境變化極為敏感的高保守性蛋白質，廣泛參與了各種生理代謝途徑，近年來已成為生物 研究領域中的一個熱點。根據其分子量的大小可將其分為不同的蛋白家族，其中Hsp70與 溫度脅迫應激性密切相關。溫度是影響生物體生存至關重要的環境因子，只有在一定的溫 度范圍內生物體才能進行物質能量代謝W維持正常生理活動，超出溫度的耐受范圍都會使 生物的生長發育停滯甚至死亡。一般來說生物體受到高溫或低溫刺激后，蛋白合成量會有 顯著變化，用W增強抗逆境能力。由于熱激蛋白會在脅迫消除后一段時間內保持一定的含 量使生物體更好生存，可W認為其存在對于生物體適應環境有著重要作用。
[0004] 周氏曬小蜂紐(wioiaci/neaYang是我國重要入侵物種美國白蛾 化oAs打friaci/nea(Drury)的重要寄生性天敵，體長1. 1-1. 5mm，群集內寄生于美國白蛾蛹 中，是抑制美國白蛾的主要天敵因子，對控制美國白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美國 白蛾外，還可寄生于鱗翅目的枯葉蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和雙翅目的蛹科、 寄蛹科及銷翅目的葉甲科和瓢甲科等。
[0005]通過野外釋放C 可W達到有效防治美國白蛾的目的。然而，在野外環境 下，C 的活力會受到多重因素的影響，其中，溫度作為一個主要生態因素，會影響C 的生命力。在合適的溫度范圍投放小蜂，才會起到更好的防治效果。
[0006] 實時巧光PCR技術是在常規PCR技術的基礎上發展起來的核酸定量技術。實時巧 光PCR不僅實現了常規PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，實時巧光PCR技 術由自動化儀器收集巧光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進一步提高靈敏度；實時巧光 PCR技術全封閉反應，無須PCR后處理，避免污染，保證了結果的可靠性和重復性。目前，已 廣泛應用于分子生物學和醫學研究等領域。隨著實時巧光PCR試劑盒的進一步開發，近年 來，實時巧光PCR技術在動物生態防治中也得到了廣泛的應用。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是公開一種采用巧光RT-PCR技術檢測周氏曬小蜂Hsp70基因表達 的方法。
[000引為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下： 設計一種采用巧光RT-PCR技術檢測周氏曬小蜂化p70基因表達的特異性引物，其特 征在于包括符合巧光PCR反應特點的特異上下游引物：Hsp70-F:5'-GACTTGGGCACCACATACT -3'；Hsp70-R:5'-GTCCGTGAAGGCAACATAG-3' ； 本發明所述特異性引物快速檢測周氏曬小蜂化p70基因表達的方法，其特征在于按如 下步驟進行： (1)使用下述引物進行該基因的檢測： 符合巧光PCR反應特點的該序列特異上下游引物： Hsp70-F:5' -GACTTGGGCACCACATACT-3' Hsp70-R:5'-GTCCGTGAAGGCAACATAG-3' (1)總RNA的提取：采用各種通用的RNA提取方法，從周氏曬小蜂成體中提取總RNA; (3) CDNA合成：W周氏曬小蜂總RNA為模板合成cDNA，反應體系為20yL; (4) 實時巧光PCR:W上述合成的cDNA為模板，上述（1)中Hsp70-F和Hsp70-R、GADPH-F 和GADPH-R為特異性引物，進行實時巧光PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴增后所 得3個平行管的Ct值取平均數。
[0009] (5)周氏曬小蜂在不同溫度下Hsp70基因相對表達量計算： 實時巧光PCR后，當目的基因與內參基因的擴增效率相近時，采用廠& &ET法計算不同 溫度下Hsp70基因相對于內參GADPH基因的mRNA相對表達量。
[0010] 本發明所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為25ymol/L的膽存液， 工作濃度為0. 5ymol/L。
[0011] 本發明進一步公開了采用巧光RT-PCR技術檢測周氏曬小蜂化p70基因表達的特 異性引在制備檢測周氏曬小蜂適應外界環境變化方面的應用。實驗結果表明：圖1為不同 溫度下周氏曬小蜂化p70基因的相對表達量。從圖中看出無論是高溫還是低溫都可W影響 周氏曬小蜂體內的化p70的表達。在低溫脅迫的情況下，隨著溫度的不斷降低，周氏曬小蜂 體內的化p70的相對表達量呈上升的趨勢，并且在-7°C時達到最大表達量；在高溫脅迫的 情況下，隨著溫度的不斷升高，周氏曬小峰體內的Hsp70的相對表達量也呈上升的趨勢，但 在40°C時達到最大表達量。運對于W后在何種室外溫度下放飛白蛾周氏曬小蜂防治美國白 蛾具有重要意義。
[0012] 本發明提供的特異性引物快速檢測周氏曬小蜂化p70基因表達的方法與現有技 術相比的有益效果是： (1)本發明采用的實時巧光RT-PCR技術與常規PCR相比，實時巧光PCR技術由自動 化儀器收集巧光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進一步提高靈敏度；實時巧光PCR技術 全封閉反應，無須PCR后處理，避免污染，保證了結果的可靠性和重復性。實時巧光RT-PCR 技術也免除了常規PCR中的電泳、定量掃描等后續繁瑣步驟，大大縮短了實驗時間。
[0013] (2)在通過RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp70基因表達的變化，結果顯示在 不同溫度條件下周氏曬小蜂體內的Hsp70基因的表達水平處于一個動態過程中，高溫和低 溫脅迫都使周氏曬小蜂體內Hsp70有一個高的表達量，在40°C和-7°C體內表達量最大。
[0014] (3)因此本發明提出研究了周氏曬小蜂適應外界環境的變化，避免受到脅迫因子 對自身的傷害的保護機制，對于防治美國白蛾有重大意義，為綠色防治林業害蟲提供了一 個新的思路和技術。
[001引周氏曬小蜂熱激蛋白化p70基因，其CDNA序列和編碼氨基酸的序列如序列表1、表 2所示。
[0016] 表1周氏曬小蜂Hsp70cDNA全長
【附圖說明】
[0017] 圖I為周氏曬小蜂化p70在相同時間不同溫度脅迫下表達變化。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例說明本發明，運里所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專 業人員按照本發明的精神可W對其進行改進和變化，所述的運些改進和變化都應視為在本 發明的范圍內，本發明的范圍和實質由權利要求來限定；其中所用試劑均有市售。本發明中 所述的提取白蛾周氏曬小蜂總RNA的提取，CDNA的合成，實時巧光定量RT-qPCR等方法都 是本領域成熟的技術，試劑盒TransSc;ript?RT、TransSta;rt?TopGreenqPCRSuperMix等 都可W從生產商家購買。
[001引 實施例1 : 獲得白蛾周氏曬小蜂Hsp70基因序列 實驗材料取自室內傳代培養的白蛾周氏曬小蜂(培養條件：于人工氣候箱（PQX-350H) 中，溫度25°C，相對濕度60^^80%，無光黑暗)。取羽化后24h內的雌性周氏曬小蜂，于解剖 鏡下切取觸角，立即浸于RNAlater(Ambion公司，AM702