單胞菌細胞催化劑。
[0024]根據實施例1所述的方法在405 nm下檢測施氏假單胞菌固定化細胞的水解活力，當海藻酸鈉與PVA的混合溶液中海藻酸鈉的質量體積分數為3 %時，固定化細胞的水解活力為 4.43 U/mg ο
[0025]實施例3
'洛Pseudomonas stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)種子液接種到發酵培養基中，接種量為2 % (v/v)，發酵液培養基(w/v)為0.2 %葡萄糖，0.5 %酵母浸膏，1 %(NH4) 2S04，0.8 % K2HP04, 0.15 % MgS04.7H20，其余成分為水；pH 為 8.0 ± 0.1。25 °C，200 rpm條件下培養48 h，在4 °C下以10000 rpm離心10 min后得到菌體，真空冷凍干燥24 h，懸浮于生理鹽水中。
[0026]本實施例固定化載體的滅菌處理的具體步驟與實施例1相同，不同之處在于，本實施例采用的PVA的質量體積分數不同，以說明PVA的配比對固定化細胞水解活力的影響。具體操作如下，按實施例1完成施氏假單胞菌的收集及菌懸液的制備后，配制100 mL海藻酸鈉質量體積分數為5 %的海藻酸鈉與PVA的混合溶液，200 mL CaCl2濃度為0.2 mol/L的飽和硼酸-CaCl2溶液，再分別配制PVA不同質量體積濃度(0 % ~ 12 %)的海藻酸鈉與PVA的混合溶液，4 °C條件下固定4 h，其他的固定化步驟按實施例1進行，制得實驗所需固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。
[0027]將上述固定化細胞按照實施例1所述的方法在405 nm下檢測固定化施氏假單胞菌細胞催化劑的水解活力，當PVA的質量分數為5 %，固定化細胞的水解活力為4.51 U/mg ο
[0028]實施例4
'洛Pseudomonas stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)種子液接種到發酵培養基中，接種量為5 % (v/v)，發酵液培養基(w/v)為0.2 %葡萄糖，0.5 %酵母浸膏，1 %(NH4)2S04, 0.8 % K2HP04, 0.15 % MgS04.7H20，其余成分為水；pH 為 8.0 ± 0.1。40 °C，80 rpm條件下培養36 h，在4 °C下以10000 rpm離心10 min后得到菌體，真空冷凍干燥24 h，懸浮于生理鹽水中。
[0029]本實施例固定化載體的滅菌處理的具體步驟與實施例1相同，不同之處在于，本實施例固定化時飽和硼酸_CaCl2溶液中CaCl 2的濃度為0.05 -1.0 mol/L，以確定CaCl 2的濃度對固定化細胞水解活力的影響。具體操作如下，按實施例1完成施氏假單胞菌的收集及菌懸液的制備后，配制100mL混合載體溶液，其中海藻酸鈉和PVA的質量體積分數分別為1 %和8 %，固定化載體/催化劑干重比為50:1，0 °C條件下固定8 h其他的固定化步驟按實施例1進行，制得固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。
[0030]按實施例1所述方法測定固定化施氏假單胞菌細胞催化劑的水解活力，當CaCl2的濃度為0.3 mol/L，施氏假單胞菌固定化細胞的水解活力為4.01 U/mg。
[0031]實施例5
'洛Pseudomonas stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)接種到發酵培養基中，接種量為3 % (v/v)，發酵液培養基(w/v)為0.8 %葡萄糖，0.5 %酵母浸膏，0.1 %(NH4)2S04, 0.2 % K2HP04, 0.009 % MgS04.7Η20，其余成分為水；pH 為 8.0 ± 0.1。30 °C，200 rpm條件下培養72 h，在4 °C下以12000 rpm離心5 min后得到菌體，真空冷凍干燥36 h，懸浮于生理鹽水中。
[0032]本實施例固定化載體的滅菌處理的具體步驟與實施例1相同，不同之處在于，本實施例固定化載體與施氏假單胞菌干重比為(50 ~ 250):1，以確定固定化載體與催化劑的比例對固定化細胞水解活力的影響。具體操作如下，按實施例1完成施氏假單胞菌的收集及菌懸液的制備后，配制lOOmL海藻酸鈉-PVA混合溶液，其中海藻酸鈉和PVA的質量體積分數分別為3 %和3%，200 mLCaClj^濃度為1.0 mol/L的飽和硼酸-CaCl 2溶液，按不同的固定化載體/催化劑比例加入施氏假單胞菌(50:1~250:1)，固定化12h，其他的固定化步驟按實施例1進行，制得固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。
[0033]將上述固定化細胞按照實施例1所述的方法在405 nm下檢測固定化施氏假單胞菌細胞催化劑的水解活力，綜合考慮，固定化載體與施氏假單胞菌干重比為150:1，此時固定化細胞的水解活力為3.44 U/mg ο
[0034]實施例6
'洛Pseudomonas stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)種子液接種到發酵培養基中，接種量為4 % (v/v)，發酵液培養基(w/v)為1 %葡萄糖，3 %酵母浸膏，1 %(NH4) 2S04，0.4 % Κ2ΗΡ04，0.2 % MgS04.7Η20，其余成分為水；pH 為 7.0 ± 0.1。37 °C，150rpm條件下培養48 h，在4 °C下以8000 rpm離心15 min后得到菌體，真空冷凍干燥12 h，懸浮于生理鹽水中。
[0035]本實施例固定化載體的滅菌處理的具體步驟與實施例1相同，不同之處在于，本實施例采用的固定化時間不同，以確定固定化時間對固定化施氏假單胞菌細胞水解活力的影響。具體操作如下，按實施例1完成施氏假單胞菌的收集及菌懸液的制備后，配制100 mL混合載體溶液，其中海藻酸鈉和PVA的質量體積分數分別為3 %和5 %，200 mLCaCl2的濃度為0.5 mol/L的飽和硼酸-CaCl2溶液，固定化載體與施氏假單胞菌干重比為100:1，按實施例1方法進行固定化，固定化時間為0.5 h~12 h，制得固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。
[0036]將上述固定化細胞按照實施例1所述的方法在405 nm下檢測固定化施氏假單胞菌細胞催化劑的水解活力，當固定化時間為4 h，此時固定化細胞的水解活力為4.32 U/mg ο
[0037]以上實施例表明，通過固定化方法的實施，可以獲得具有更高水解活力的施氏假單胞菌固定化細胞，其具有更高的生產強度，而且具有方便回收、可重復利用的明顯優勢。
【主權項】
1.一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，包括以下步驟: 施氏假單胞菌經活化培養、發酵培養得到菌液，菌液離心分離得菌體，菌體干燥備用； (2)將步驟(1)得到的菌體接入經高壓滅菌冷卻的海藻酸鈉與PVA的混合溶液中，混勻后注入攪拌的飽和硼酸_CaCl2溶液中固定化，過濾得到小珠后用蒸餾水洗滌，再經冷凍干燥制得固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。2.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，步驟(1)所述施氏假單胞菌為stutzeri GIM1.273，購自廣東省微生物研究所。3.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，步驟(1)所述發酵培養的培養基中各成分的質量體積分數為:葡萄糖0.1 °/『5%，酵母浸膏 0.1 %~5 %，(NH4)2S04 0.2 %~3 % g，Κ2ΗΡ04 0.02 %~1 %g，MgS04.7H20 0.002%~0.2 %，其余成分為水；培養基中初始pH值為6.0-8.0。4.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，步驟(1)所述發酵培養條件為溫度20°C -40 °C，轉速120~200 r/min,震蕩培養0.5 d~3 do5.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，所述細胞固定化采用包埋法-交聯法聯合使用的方法。6.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA在混合溶液中的質量體積分數分別為0.5 °/『8 %與 0 %~12 %o7.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA的混合溶液為固定化載體，其中固定化載體與施氏假單胞菌干重比為(50 ~ 250): 1。8.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，步驟(2)所述的飽和硼酸_CaCl2溶液為交聯劑，所述交聯劑中CaCl 2濃度為0.05mol/L~l.0 mol/L，硼酸為飽和硼酸溶液。9.根據權利要求1所述的一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，其特征在于，步驟(2)所述固定化的溫度為0 °C~ 10 °C，固定化的時間為0.5 h~24 h。
【專利摘要】本發明公開了一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，該方法是以海藻酸鈉和聚乙烯醇（PVA）為基體，與施氏假單胞菌菌體的生理鹽水懸浮液混合，混勻后注入CaCl2溶液中，固化得到。本發明所述的施氏假單胞菌細胞固定化方法工藝簡單，固定化細胞顆粒機械強度高，彈性好，水解活性高，在反應體系中耐受性強。本發明方法得到一種新型的具有高效水解活力的固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。
【IPC分類】C12N11/08, C12N11/10
【公開號】CN105296458
【申請號】CN201510858567
【發明人】李曉鳳, 雷發玲, 辛璇, 趙光磊, 吳暉, 余以剛, 唐詩潮
【申請人】華南理工大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月30日