一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程技術應用領域，具體涉及一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法。
【背景技術】
[0002]固定化細胞技術是用于獲得細胞的酶和代謝產物的一種方法，是在固定化酶的基礎上發展起來的新技術。由于固定化細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，所以又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞。通過各種方法將細胞和水不溶性載體結合，制備固定化細胞的過程稱為細胞固定化。
[0003]與游離的細胞相比，固定化的細胞具有顯著的優點:1)固定化可以提高菌體的穩定性；2)固定化細胞易于分離進而簡化產物的分離純化；3)可以獲得更高的細胞濃度；4)細胞的種類多種多樣，大小和特性各不相同，故此細胞固定化的方法有很多種，固定化的方法主要有吸附法、包埋法、交聯法。吸附法是利用各種吸附劑，將細胞吸附在其表面而使細胞固定的方法，用于細胞固定化的吸附劑主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金屬絲網、微載體和中空纖維等。包埋法是將細胞包埋在多空載體內部而制成固定化細胞的方法，可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。交聯法是依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶于水從而形成固定化酶，常采用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。
【發明內容】
[0004]本發明目的在于進一步優化現有技術，提供一種高效水解活力施氏假單胞菌細胞的固定化方法。
[0005]本發明通過以下技術方案來實現:
一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細胞固定化方法，包括以下步驟:
(1)施氏假單胞菌經活化培養、發酵培養得到菌液，菌液離心分離得菌體，菌體干燥備用；
(2)將步驟(1)得到的菌體接入經高壓滅菌冷卻的海藻酸鈉與PVA的混合溶液中，混勻后注入攪拌的飽和硼酸_CaCl2溶液中固定化，過濾得到小珠后用蒸餾水洗滌，再經冷凍干燥制得固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。
[0006]進一步地，步驟(1)所述施氏假單胞菌為stutzeri GIM1.273，購自廣東省微生物研究所。
[0007]進一步地，步驟(1)所述發酵培養的培養基中各成分的質量體積分數為:葡萄糖0.1 %~5 %，酵母浸膏 0.1 %~5 %，(NH4)2S04 0.2 %~3 % g，Κ2ΗΡ04 0.02 %~1 %g，MgS04.7H20
0.002 %~0.2 %，其余成分為水；培養基中初始pH值為6.0-8.0。
[0008]進一步地，步驟(1)所述發酵培養條件為溫度20 °C -40 °C，轉速120~200 r/min，震蕩培養0.5 d~3 do
[0009]進一步地，所述細胞固定化采用包埋法-交聯法聯合使用的方法。
[0010]進一步地，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA在混合溶液中的質量體積分數分別為0.5 %~8 % 與 0 %~12 %。
[0011]進一步地，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA的混合溶液為固定化載體，其中固定化載體與施氏假單胞菌干重比為(50 ~ 250): 1。
[0012]進一步地，步驟(2)所述的飽和硼酸_CaCl2溶液為交聯劑，所述交聯劑中CaCl 2濃度為0.05 mol/L~l.0 mol/L，硼酸為飽和硼酸溶液。
[0013]進一步地，步驟(2)所述固定化的溫度為0 °C~ 10 °C，固定化的時間為0.5 h~24
ho
[0014]進一步優化地，本發明的目的通過以下技術方案實現:
(1)施氏假單胞菌的獲取:將施氏假單胞菌活化后接種至誘導培養基中，接種量為1%~10 % (v/v)，培養溫度為25 °C -40 °C，轉速為120~200 rpm，培養時間為12 h~72 h，高速冷凍離心分離得到菌體，離心溫度為0°C ~12°C，轉速為8000 rpm~13000 rpm,經真空冷凍干燥6~48 h，懸浮于生理鹽水中；
(2)配制海藻酸鈉與PVA的混合溶液，并進行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件是121°C, 10-30min，冷卻備用；
(3 )將步驟(1)所得菌懸液加入步驟(2 )所得的混合溶液中，渦旋振蕩混勻，得混合物；
(4)用注射器將步驟(3)得到的混合物勻速注入硼酸-CaCl2S液中，0 °C~ 4 °C下固定化0.5 h~24 h，過濾干燥制得施氏假單胞菌固定化細胞；
進一步地，步驟(1)所述的施氏假單胞菌活化培養的具體操作為:從試管保存的菌種中挑1~2環至50~200 mL營養肉湯培養基中震蕩培養，培養溫度為25~40°C，培養時間為6h~48 h ；
進一步地，步驟(1)所述的誘導培養基為葡萄糖0.1 %~5 % (w/v，下同)，酵母浸膏0.1%~5 %，(NH4)2S04 0.2 %~3 % g, Κ2ΗΡ04 0.02 %~1 %g, MgS04*7H20 0.002 %~0.2 %，其余成分為水；初始pH值6.0 ~ 8.0，培養溫度為25~40°C，培養時間為6 h~48 h ；
進一步地，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA的混合溶液為固定化載體，其中各物質的質量體積分數分別為:海藻酸鈉0.5 %~8 %、PVA 0 %~12 % ；
進一步地，步驟(3)的固定化載體與菌體干重比為(50 ~ 250): 1 ；
進一步地，步驟(4)所述的硼酸-CaC12溶液為飽和硼酸和0.05-1.0 mol/L CaCl2S
液；
進一步地，步驟(4)所述的固定化過程中需慢速攪拌硼酸_CaCl2溶液；
進一步地，步驟(4)所述的干燥方法為真空冷凍干燥，干燥時間為6 h~48 ho
[0015]本發明具有以下的優點:
1、本發明制備固定化細胞生物制劑的方法簡便，聯合采用了包埋法和交聯法，細胞不易滲透，并且傳質性能好，同時增加了機械強度。
[0016]2、本發明制備的固定化細胞具有處理效率高、水解活性高、穩定性強、易于分離回收循環利用等優點。
【具體實施方式】
[0017]
為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，需要說明的是，這些實施例并不構成對本發明保護范圍的限制。
[0018]實施例1
將Pseudomoms stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)種子液接種到發酵培養基中，接種量為1 % (v/v), 35 °C，150 rpm條件下培養24 h，在10 °C下以8000 rpm離心10 min后得到所需菌體，真空冷凍干燥24 h。固定化載體為100mL海藻酸鈉和PVA的混合溶液，其中海藻酸鈉的質量體積分數為2%，PVA的質量體積分數為5%，固定化載體經高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，按固定化載體:施氏假單胞菌干重=100:1加入菌粉，渦旋振蕩混勻后用注射器勻速注入200mLCaCl2濃度為0.3 mol/L的飽和硼酸-CaCl 2溶液中，4°C固定化6 h，得到的小珠經100目濾布過濾后，用蒸餾水洗去表面未固定的細胞和Ca2+，干燥，得到淺黃色小珠，為固定化施氏假單胞菌細胞催化劑。
[0019]菌種培養方法:種子培養基，營養肉湯；發酵液培養基(w/v)為1 %葡萄糖，1 %酵母浸膏，1.2 %(NH4)2S04，0.1 % Κ2ΗΡ04，0.01 % MgS04.7H20，其余成分為水；pH 為 7.0 土
0.Ιο
[0020]采用以下方法測定固定化施氏假單胞菌細胞催化劑的水解活力，包括以下操作:在10 mL反應瓶中加入0.6 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS，50 mM, pH 8.0),0.1 mL溶于異丙醇的p-NPP溶液，混合均勾，再置于40°C，180 rpm預熱5 min,加入50 mg上述所得固定化施氏假單胞菌細胞催化劑，40 °C，180 rpm反應10 min，立即加入Na2C03溶液終止反應，用酶標儀測A4(]5，該吸光度代入標準曲線方程后，可計算出待測樣品中的水解活力，單位為U/
mg ο
[0021 ] 按照上述的方法檢測固定化施氏假單胞菌細胞催化劑的水解活力，同時檢測市面買的固定化酶Novozyme 435的水解活力。最終檢測到固定化施氏假單胞菌細胞催化劑的水解酶活為4.23 U/mg，Novozyme435的水解活力為2.44 U/mg。
[0022]實施例2
'洛Pseudomonas stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)種子液接種到發酵培養基中，接種量為4 % (v/v)，發酵液培養基(w/v)為5 %葡萄糖，5 %酵母浸膏，3 %(NH4)2S04, 0.08 % K2HP04, 0.1 % MgS04.7H20，其余成分為水；pH 為 8.0 ± 0.1。25 °C，150 rpm條件下培養60 h，在4 °C下以10000 rpm離心10 min后得到菌體，真空冷凍干燥12 h，懸浮于生理鹽水中。
[0023]本實施例固定化載體滅菌處理的具體步驟與實施例1相同，不同之處在于，本實施例海藻酸鈉的質量體積分數不同，以說明海藻酸鈉的質量體積分數對固定化細胞水解活力的影響。具體操作如下，按上述要求完成施氏假單胞菌的收集及菌懸液的制備后，配制lOOmLPVA質量體積分數為2%的混合溶液，按固定化載體:施氏假單胞菌干重=100:1加入菌粉，再分別配制海藻酸鈉不同質量體積濃度(0.5 °/『8 %)的海藻酸鈉與PVA的混合溶液，10 °C下在200mL1.2 mol/L的飽和硼酸_CaCl2溶液中固定化2 h，其他的固定化步驟按實施例1進行，制得固定化施氏假