20%D單獨滅菌，倒平板之前按1:9向YP中加入20%D ;篩選抗性為80ug/ml Amp)，30°C倒置培養3-4天，在抗性平板上生長的為含有重組質粒的陽性克隆子。
[0053]取重組質粒pPIC9k_Agarasel轉化的畢氏酵母GS115菌株陽性克隆子，接種于150mL YH)培養液中，30°C 250rpm振蕩培養至0D6QQ= 0.3?0.5 (約20hr)，然后接種于3L發酵基本培養基(26.2 ml/L磷酸，0.80 g/L硫酸鈣，18.7 g/L硫酸鉀，15.5 g/L硫酸鎂，4.17 g/L氫氧化鉀，Glucose 40 g/L葡萄糖)中，于5L發酵罐中進行發酵。
[0054]在起始階段一一菌體生長階段，發酵過程中用25%的氨水調節pH，使其維持在
6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1 (30 mM硫酸銅，0.54 mM碘化鈉，17.6 mM硫酸錳，
0.80 mM鉬酸鈉，0.32 mM硼酸，2.4 mM氯化鈷，0.18 mM氯化鋅，0.24 mM硫酸亞鐵，1.6 mM生物素，0.19 Μ硫酸)，進行連續流加補料。攪拌并通氣培養20-24hr，在菌體生長過程中溶氧逐漸下降至低于100 %，直至碳源耗盡，溶氧又逐漸上升至高于80 %，此時菌濕重可達到90g/Lo
[0055]進入碳源飼喂階段，以25mL/h的速度流加用蒸餾水配置的含有25% (w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持續流加4_6hr，并調節通氣量，使溶氧維持在20%上下，到代該階段的末期，菌濕重可達到160g/L。
[0056]在誘導階段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培養基中甲醇的終濃度最高不要超過0.3% (v/v)，并調節通氣量，使溶氧維持在20%上下。在誘導階段的發酵過程中每隔24hr取樣10ml，lOOOOrpm離心5min，收集上清液測定Agarase活力并進行SDS-PAGE分析，結果分別如圖2所示。發酵190h時，菌濕重可達到243.57g/L，Agarase的表達水平(以發酵液上清的酶活力表示)可達到4444.03U/ml，這說明Microbulbiferthermo toleranslMh Agarase基因均在畢氏酵母中得到了表達和積累。
[0057]實施例4重組Agarase的純化
將實施例3所制備的發酵培養液lOOOOrpm離心lOmin去除菌體，取上清液作為粗酶液，用截留分子量為6000Da的外壓式中空纖維超濾膜進行超濾，以去除粗酶液中小分子的雜質，并將其濃縮3-5倍。
[0058]將上面所得粗酶液的濃縮液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至55%，13000rpm離心15min，取沉淀，用緩沖液重新溶解，置于截留分子量為6000Da的透析袋中，以pH8.0，20mM Tris-HCl為透析外液，透析外液與內液的體積比大于50，4°C透析12_16h，中間每隔4h更換透析外液一次，透析完后，取透析內液用真空旋轉蒸發儀進行濃縮，再進行冷凍干燥后，置于-20°C的低溫冰箱中保存待用。
[0059]取20mg上面所得到的凍干粉末于離心管中，加入2ml Tris-HCl (pH8.0,50mM)緩沖液，使其充分溶解后，上TOSOH Toyopearl DEAE-650C陰離子柱。先用pH8.0，50mMTris-HCl緩沖液平衡柱子，然后流加樣品，再用相同緩沖液配置的0-0.8mol/L NaCl梯度洗脫5個柱體積，流速為lml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后對收集管中的溶液測定Agarase活力及蛋白電泳分析。SDS-PAGE結果(圖3 )表明，Microbulbiferthermotolerans絮源、飽Agarase純化后僅有單一的條帶，分子量均約為44kDa。
[0060]實施例5重組Agarase的酶學性質分析
將實施例4所制備的Agarase在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。所用緩沖液為PH4.0-8.0的廣泛緩沖液(檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、氫氧化鈉、巴比妥)。Agarase在不同的pH的緩沖液中，50°C下測定pH的適性結果，表明Microbulbifer thermo tolerans來源的Agarase的最適pH為7.0 (圖4)。
[0061]最適反應溫度的測定在磷酸鹽(ρΗ7.0)緩沖體系及不同溫度下(35°C _75°C)進行酶促反應。熱穩定性研究為在不同溫度下處理10-60min，再進行酶活性測定。酶促反應最適溫度測定結果(圖4)表明，Agarase的最適反應溫度為50°C。
[0062]實施例6重組Agarase酶解瓊膠的分析
瓊膠能夠用于制備瓊膠寡糖，瓊膠寡糖因在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌、抑菌等眾多方面具有生理活性而備受關注。然而，作為一種天然多糖，瓊膠的分子量大、粘度高、溶解性低，因此難以被人體分解吸收，不能發揮瓊膠寡糖的生理活性。因此，通過降解瓊膠制備能夠被人體直接吸收的瓊膠寡糖，就成為一個極為有意義的研究。本專利中利用生產的重組Agarase來探討其降解瓊膠的效果。
[0063]1、重組Agarase酶解瓊膠的分析
(1)材料:發酵得到的瓊膠酶酶液，0.3%瓊膠底物，層析紙，層析液(其中各體積比正丁醇:乙醇:水=2:1:1)，染色液(苯胺-二苯胺)，糖標準品等。
[0064](2 )實驗過程:①將0.5mL的瓊膠酶液與0.5mL的底物在混合液50 °C下保溫lh。
[0065]②取保溫后的混合液10 μ L在層析紙中上樣，上樣過程中要保證層析紙一直保持干燥狀態。取2 yL糖標準品在層析紙中上樣。
[0066]③上樣完成后，將層析紙放入層析液中，3_4h。
[0067]④將層析紙層析液中拿出，用吹風機吹干。再用染色液對層析紙染色，保證染色均勻。染完色后，放入70°C烘箱烘干，15min后觀察實驗結果。結果由圖可知，瓊膠酶與底物的最終產物主要是二糖和四糖。實驗結果如圖5所示。
[0068]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種瓊膠酶，其特征在于:所述瓊膠酶氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.一種瓊膠酶基因，其特征在于:編碼權利要求1所述瓊膠酶；所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。3.包含權利要求2所述瓊膠酶基因的重組載體，其特征在于:所述載體是大腸桿菌質粒或酵母質粒。4.根據權利要求3所述的重組載體，其特征在于:所述的載體為pPIC9k-Agarase。5.一種包含權利要求2所述的瓊膠酶基因的細胞，其特征在于:所述細胞選大腸桿菌細胞或酵母細胞；所述細胞由權利要求3所述重組載體轉化而得。6.根據權利要求5所述的細胞，其特征在于:所述細胞是包含所述瓊膠酶核苷酸序列或用所述重組載體轉化的大腸桿菌細胞或畢赤酵母細胞。7.一種如權利要求2所述的瓊膠酶基因的制備方法，其特征在于:所述瓊膠酶的制備步驟包括:瓊膠酶基因的獲得:從海泥中篩選得到一株能在瓊膠平板上產生透明圈的微生物，通過16srDNA分析鑒定為耐熱微球菌{Microbulbifer thermotolerans);利用瓊膠酶氨基酸保守片段的簡并引物，獲得其一段瓊膠酶的編碼基因；再通過genome walking獲得其全長，并在NCBI數據庫中進行比對分析，得到瓊膠酶基因。8.—種如權利要求3所述的瓊膠酶基因的重組載體的制備方法，其特征在于:所述瓊膠酶基因的重組載體的制備為:采用權利要求2所述瓊膠酶基因編碼序列經說成1和Not I雙酶切后與說oRI和Not\雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達載體pPIC9k_Agarase。9.一種如權利要求5所述的的瓊膠酶基因的細胞的構建方法，其特征在于:所述細胞是用所述重組載體轉化來構建的；所述細胞選大腸桿菌細胞和酵母細胞，選用大腸桿菌和畢赤酵母構建表達瓊膠的重組細胞。10.一種如權利要求1所述的瓊膠酶的制備方法，其特征在于:培養所述包含瓊膠酶基因的細胞或包含瓊膠酶基因的重組載體轉化的細胞，誘導其表達，收獲表達產物:通過包含本發明瓊膠酶基因的酵母發酵來生產瓊膠酶，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。
【專利摘要】本發明提供一種瓊膠酶及其制備方法，以及將其在大腸桿菌和酵母細胞中克隆表達的方法，所述瓊膠酶的核苷酸序列的如SEQ？NO.1所示；瓊膠酶的氨基酸序列如SEQ？NO.2所示；核苷酸分子的載體是大腸桿菌質粒或酵母質粒；核苷酸分子的細胞由所述載體轉化而得；所述瓊膠酶的核苷酸分子的細胞是包含所述核苷酸分子或用所述載體轉化的大腸桿菌或包含所述核酸分子或用所述載體轉化的畢氏酵母。本發明制備出能夠高效表達并分泌瓊膠酶的重組生產株，實現瓊膠酶的生產產業化，對瓊膠和龍須菜有良好的水解能力。
【IPC分類】C12N15/81, C12N1/19, C12N9/24, C12N1/21, C12N15/66, C12N15/56, C12N9/38, C12N15/70
【公開號】CN105296448
【申請號】CN201510745912
【發明人】李仁寬, 葉秀云, 陳增
【申請人】福建福大百特科技發展有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月6日