一種瓊膠酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，更具體涉及一種瓊膠酶、其編碼序列、含有該序列的重組質粒和菌株，以及由所述序列編碼的瓊膠酶在大腸桿菌中的表達和在酵母細胞中的發酵生產。
技術背景
[0002]瓊膠酶是一類來自海洋微生物細胞和海洋動物體內的一種水解酶，可以水解瓊脂產生瓊膠寡糖。近幾年，隨著糖生物學的高度發展和深入研究，越來越多的海藻多糖及其水解產物得到了許多學者高度的關注，其中對于瓊膠寡糖的研究就是其中的重要的一例。瓊膠寡糖有多種重要的生物活性，加之其在保健食品工業上的應用與發展，有關瓊膠寡糖的研究及應用成為了結構化學、分子生物學、醫學和食品學等研究領域的熱點之一。
[0003]對瓊膠酶的研究較早的是在1957年，Yaphe用來白大西洋假單胞菌屬的瓊膠酶進行了對美國Difco瓊脂、新西蘭Davis瓊脂和石花菜屬、江籬屬、雞毛菜屬以及龍須菜等的水解研究，表明了該瓊膠酶對這些底物均有水解作用。同時進行了對含有多糖結構的角叉菜膠的水解研究，該瓊膠酶對其沒有水解作用。該瓊膠酶水解底物產生的低聚糖都以新瓊二糖作為基本結構單元。
[0004]1968年，Duckworth等從一株噬細胞菌屬細菌培養液中分離純化得到胞外瓊膠酶。該瓊膠酶作用于紫菜膠的最佳pH條件為7.2，溫度為40~41°C。其作用方式為內切，可以在低濃度下快速降低瓊膠和紫菜膠的粘度。對很多多糖的水解作用表明該瓊膠酶對瓊脂結構的糖類具有高度的專一性。1969年，Duckworth等對同樣從噬細胞菌屬細菌培養液中分離純化得到瓊膠酶進行研究，表明了該瓊膠酶對于新瓊二糖、新瓊四糖或其含有6-0-甲基-D-半乳糖還原端的類似物沒有活性。對新瓊八糖的作用方式表明其為切斷中心的D-半乳糖苷鍵生成兩分子的四糖，但是對于八聚糖和六聚糖的外部的D-半乳糖苷鍵的水解作用很弱。該瓊膠酶對硫酸鹽化的低聚糖的水解表明在低聚糖中必須要有新瓊四糖還原端。
[0005]1990年，Aoki等采用硫酸錢沉淀、連續的柱色譜法從一株弧菌屬種分離純化出一種聲瓊膠酶。該瓊膠酶的相對分子量20 kDa，最適作用pH值為5.5，在pH 4.0-9.0范圍內和溫度為45°C以下都很穩定。該瓊膠酶是一種內切酶，并且對新瓊四糖、聚合度較大的寡聚糖和瓊膠都具有水解作用，但是對卡拉膠沒有水解作用。
[0006]1992年，Leon等從一株交替單胞菌屬菌株中分離純化出一種胞外的瓊膠酶，研究了該瓊膠酶的一些酶學性質。其相對分子質量為52 kDa，對一些鹽敏感，最佳作用pH值約為6.5。1993年，potin等對單胞菌屬的菌株GJ1B產生的瓊膠酶進行了分離純化，該瓊膠酶系α -瓊膠酶。他們對1978年發現的末鑒定的菌株GJ1B進行了研究，利用13C_NMR研究了該菌株水解瓊脂的產物，并且將該菌株歸類為單胞菌屬。
[0007]2002年，Suzuki等從桿菌MK03中分離純化得到一種能夠水解低聚合度的α -瓊膠寡糖的水解酶。采用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析以及凝膠柱層析的方法對酶進行了分離純化，SDS-PAGE和凝膠柱分別表明該酶的相對分子量為320kDa和42 kDa,說明了其為八聚糖。該水解酶能夠水解新瓊二糖的a-1，3糖苷鍵，其N-末端的氨基酸序列和當時己知的水解瓊膠寡糖的酶和瓊膠酶都沒有相似性，因此是個新型的α -瓊膠寡糖水解酶。
[0008]Ohta等在2005年從一株嗜鹽菌JAMB-A3 3中分離得到一種α -瓊膠酶，該菌株分離自日本海域的污泥中。分離得到的a-瓊膠酶相對分子質量為85 kDa該瓊膠酶水解瓊脂的作用方式為外切型的，主要的產物為新瓊四糖，同時還可以水解新瓊六糖以及紫菜膠。
[0009]2008年，Fu等從嶸螺的內臟中分離到的海洋細菌Jigetrivorems albus0 Lee等2000年研究了從海洋中分離得到的假單胞菌W7產生的β -瓊膠酶的基因序列，此瓊膠酶由1926by的開放閱讀框，由642個氨基酸組成，其相對分子質量為69，540Da。其中259個氨基酸的缺失會導致編碼的蛋自完全失去水解瓊脂的活性，說明了這259個氨基酸是編碼該瓊膠酶必不可少的氨基酸，有著重要的作用。
[0010]其后，隨著生物工程技術的高度發展和對瓊膠酶研究的日益深入，許多學者都進行了瓊膠酶的基因克隆研究，使瓊膠酶的產量和酶活都很大程度地提高了對科學研究和工業應用都作出了重要的貢獻。
【發明內容】
[0011]本發明的主要目的在于提供一種瓊膠酶及基因和制備方法，以及將其在大腸桿菌和酵母細胞中克隆表達的方法，解決上述現有技術的不足之處，制備出能夠高效表達并分泌瓊膠酶的重組生產株，實現瓊膠酶的生產產業化。
[0012]一種瓊膠酶，所述瓊膠酶氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]一種瓊膠酶基因，編碼權利要求1所述瓊膠酶；所述基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0014]包含所述瓊膠酶基因的重組載體，所述載體是大腸桿菌質粒或酵母質粒。所述的載體為 pPIC9k_Agarase。
[0015]包含所述的瓊膠酶基因的細胞，所述細胞選大腸桿菌細胞或酵母細胞；所述細胞由權利要求3所述重組載體轉化而得。所述細胞是包含所述瓊膠酶核苷酸序列或用所述重組載體轉化的大腸桿菌細胞或畢赤酵母細胞。
[0016]瓊膠酶基因的制備方法，所述瓊膠酶的制備步驟包括:瓊膠酶基因的獲得:從海泥中篩選得到一株能在瓊膠平板上產生透明圈的微生物，通過16srDNA分析鑒定為耐熱微球菌Microbulbifer iAe'Tfflo1Jerafts.;利用瓊膠酶氨基酸保守片段的簡并引物，獲得其一段瓊膠酶的編碼基因；再通過genome walking獲得其全長，并在NCBI數據庫中進行比對分析，得到瓊膠酶基因。
[0017]所述的瓊膠酶基因的重組載體的制備方法，所述瓊膠酶基因的重組載體的制備為:采用權利要求2所述瓊膠酶基因編碼序列經AcoRI和Abi I雙酶切后與說oRI和Not\雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達載體pPIC9k-Agarase。
[0018]瓊膠酶基因的細胞的構建方法，所述細胞是用所述重組載體轉化來構建的；所述細胞選大腸桿菌細胞和酵母細胞，選用大腸桿菌和畢赤酵母構建表達瓊膠的重組細胞。
[0019]所述的瓊膠酶的制備方法，培養所述包含瓊膠酶基因、的細胞或包含瓊膠酶基因的重組載體轉化的細胞，誘導其表達，收獲表達產物:通過包含本發明瓊膠酶基因的酵母發酵來生產瓊膠酶，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。
[0020]詳述
本發明涉及從海洋環境中篩選瓊膠酶產生菌及克隆瓊膠酶基因。實施方式之一，本發明提取經 16s rDNA 鑒定為 microbulbifer iAeiTW?基因組 DNA，利用 Agarase 氨基酸保守片段的簡并引物，獲取一段Agarase的編碼基因；再通過genome walking技術獲得全長，并在NCBI數據庫中進行比對分析，得到Agarase基因。實施方式之一中，所述編碼序列包含如SEQ ID N0.1所示的核酸序列，稱之為Agarase。實施方式之一中，所述編碼序列是SEQ ID N0.1中的核苷酸1至1311所示的核苷酸序列。
[0021]本發明還涉及包含所述Agarase編碼序列的重組載體，例如由各種本領域常用的表達載體制備的重組載體，其中，所述編碼序列不包含其來源微生物的內源性信號肽序列。實施方式之一中，將不帶內源性信號肽編碼序列的本發明Agarase編碼序列經方coRI和Not\雙酶切后與說oRI和Not\雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達載體pPIC9k_Agarase0
[0022]本發明還制備包含本發明Agarase編碼序列的細胞。實施方式之一中，所述細胞是用上述本發明重組載體轉化來構建的。所述細胞優選各種利于基因產物表達或發酵生產的細胞，此類細胞已為本領域熟知并常用，例如各種大腸桿菌細胞和酵母細胞。在本發明的實施方式之一中，選用畢氏酵母GS115構建表達Agarase的重組細胞。
[0023]本發明還提供了表達Agarase的方法，包括:培養前文所述本發明包含Agarase編碼序列的細胞或所述經轉化的細胞，誘導其表達，收獲表達產物，還可以可行性地包括純化表達產物的步驟。實施方式之一中，本發明通過包含本發明Agarase編碼序列的酵母(例如畢氏酵母GS115)發酵來生產Agarase，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析得到了純酶形式的目的蛋白。
[0024]本發明利用基因工程手段制備了能夠高效表達并分泌Agarase的重組生產株，實現了 Agarase的生產產業化，并獲得了優質的Agarase產品。本發明通過酶活測定和底物特異性的分析，證明本發明的Agarase對瓊膠有很好的分解能力。
【附圖說明】
[0025]圖1 耐熱微球菌{Microbulbifer thermotolerans)來源 Agarase 在質粒 pPIC9k上的重組子結構圖。其中A為Agarase與PMD18-T載體的重組質粒.B為Agarase與pPIC9k載體的重組質粒。
[0026]圖2 畢氏酵母表達耐熱微球菌{Microbulbifer thermo tolerans)來源 Agarase的 SDS-PAGE ο 1-發酵 46h ；2-發酵 53h ；3-發酵 70h