r>[0136] (6)在每一個離心管中加入100yL冰中預冷的SolutionB，輕輕彈動離心管，使沉 淀懸浮，禁止劇烈震蕩。
[0137] (7)感受態細胞制作完成，將其放在_70°C冰箱保存。
[0138] 2、連接產物pMD18-T_p53的構建
[0139] 將質粒pMD18-T與人抑癌基因p53連接，得到連接產物pMD18-T-p53;
[0140] 所述連接的反應體系為：人抑癌基因p53 8μL
[0141]質粒pMD18_T 2yL
[0142] solution I 10 μ L
[0143] 共20μL體系，將上述溶液混勻，離心后，16°C連接過夜。
[0144] 3、連接產物pMD18-T_p53的轉化
[0145] (1)從_70°C冰箱中取100μL感受態細胞懸液，將其放在冰盒中慢慢解凍；
[0146] (2)加入過夜連接好的連接產物pMD18-T-p53,輕輕混勻，冰浴上放置30min;
[0147] (3)42°C水浴中熱激lmin，然后快速將管轉移到冰浴中5min，該過程不要晃動離 心管；
[0148] (4)向管中加入500yLLB液體培養基，然后置于37°C條件下培養lh，使細菌復 蘇；
[0149] (5)將復蘇菌液搖勻后4000r/min轉離心lmin，收集沉淀，棄上清，留取菌液約 50μL；
[0150] (6)用槍輕輕吹打菌體至菌液渾濁；
[0151] (7)將菌液轉移至Kana+/LB固體培養基（LB平板）上，將菌液均勻涂開；
[0152] (8)將LB平板置于37°C培養箱中，正面放置20~40min，至液體全部吸收；
[0153] (9) 37°C恒溫培養箱中倒置過夜培養；
[0154] (10)培養結束，LB平板于4°C保存。
[0155] 4、連接產物pMD18-T-p53 的PCR檢測
[0156] (1)用滅過菌的白色槍頭挑取LB平板上的單個菌落于含有lmL LB液體培養基的 1. 5mL的離心管中；
[0157] (2)將離心管放入37°C培養箱中，培養4~5h;
[0158] (3)以培養4~5h的菌液為模板做菌液PCR，檢測單菌落是否為陽性菌落。
[0159] 連接產物pMD18-T_p53進行PCR檢測，
[0161] 加滅菌去離子水補充至總體積20yL。反應條件為：①94°C預變性5min;②PCR 擴增共40個循環：94°C預變性30s、60°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸lOmin。
[0162]PCR結果見圖3,圖3結果表明，以單菌落菌液為模板進行PCR擴增p53基因，得到 的PCR擴增片段大小約為1183bp，與預期的片段大小相符。
[0163] 5、連接產物pMD18-T_p53的提取
[0164] (1)取PCR陽性菌落菌液，放入Kana+/LB液體培養基中，在37°C培養箱中過夜培 養；
[0165] (2)將過夜培養的菌液轉移1. 5mL離心管中，8000r/min離心2min，棄上清；重復 2-3次上述步驟，倒盡或著吸干培養基，收集菌體；
[0166] (3)在菌體沉淀中加入250μLBufferP1，吸打或者震蕩至徹底懸浮菌體；
[0167] (4)加入250μLBufferP2,立即溫和顛倒離心管5~10次，室溫下靜置2-4min;
[0168] (5)加入350 μ L Buffer P3,立即溫和顛倒離心管5~10次充分混勻；
[0169] (6)于離心機最大轉速（多12000r/min)離心5~lOmin，將上清全部小心轉移至 吸附柱，9000r/min離心30s;倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；
[0170] (7)在吸附柱中加入500μL的去蛋白液BufferDW1，9000r/min離心30s;倒掉收 集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；
[0171] (8)向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000r/min離心30s，倒掉收集管中 的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；
[0172] (9)重復上述步驟⑶一次；
[0173] (10)將空吸附柱和收集管放入離心機，9000r/min離心lmin;
[0174] (11)在吸附膜中加入50μLElutionbuffer室溫下靜置1~2min，9000r/min離 心lmin，所得溶液即為連接產物pMD18-T-p53的DNA。
[0175] 6、連接產物pMD18-T_p53的酶切鑒定
[0176] 取3-5μL提取的連接產物pMD18-T-p53,進行HindIII和BamHI限制性內切酶消 化鑒定。
[0178] 總體積20μL，30°C消化4h，進行質量分數1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果 (結果見圖4)。圖4結果表明，連接產物pMD18-T-p53酶切產物的片段大小分別約為2692bp 和1183bp，與預期片段大小相符。
[0179] 7、連接產物pMD18-T_p53的酶切鑒定
[0180] 將菌液PCR為陽性，酶切消化鑒定正確的連接產物pMD18-T_p53送上海生工生物 工程有限公司測序（結果見圖5)。測序完成后運用GenBank中進行堿基序列比對及同源性 分析，測序結果與Genebank上的公布的序列（登錄號：NW_926584. 1)進行了同源性比對， 結果：序列的同源性為98%，證明成功構建了重組質粒pMD18-T-p53。
[0181] 實施例3雞MAR基因的克隆
[0182] 1、雞MAR基因的克隆引物的設計與合成
[0183] 參照GenBank雞MAR序列的全序列（登錄號：M58748. 1GI:211883)，設計要擴增的 上下游引物，由江蘇金唯智工程技術服務有限公司合成。
[0184]上游引物序列（Primerc) :5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'（SEQIDN0. 4)
[0185]下游引物序列（Primerd) :5'-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3'（SEQIDNO. 5)
[0186] 2、雞肝臟組織中MAR基因的提取
[0187] 雞肝臟組織中MAR序列的提取采用上海生動物基因組DNA提取試劑盒，具體步驟 如下：
[0188] (1)取50mg雞肝臟組織放入勾衆器中，加入100yL的BufferDigestion，用力快 速將其研磨碎，把研磨好的組織液轉入1. 5ml的離心管中，接著向勻漿器中連續兩次加入 200μL的BufferDigestion進行沖洗，接著將離心管放入65°C恒溫水浴鍋中lh直至細胞 完全裂解；
[0189] (2)加入200μLBufferPA，充分顛倒混勾，至于-20°C冰箱內放置5min;
[0190] (3)室溫下lOOOOrpm離心5min，將上清液500μL轉移到新的離心管中；
[0191] (4)加入等體積的氯仿混勻，12000rpm離心取上清；
[0192] (5)加入等體積的異丙醇，顛倒5~8次使之充分混勻，室溫下放置2~3min;室 溫下lOOOOrpm離心5min，棄上清；
[0193] (6)加入lmL質量分數75 %乙醇，顛倒漂洗l-3min，lOOOOrpm離心2min，棄上清；
[0194] (7)重復步驟6;
[0195] (8)開蓋室溫倒置5~lOmin至殘留的乙醇完全揮發；
[0196] (9)得到的DNA用100μL TE Buffer溶解，提取的DNA可立即進行下一步實驗 或-20°C保存。
[0197] 3、雞核機制結合區序列MAR基因的克隆
[0198] 雞MAR基因經過PCR擴增得到，具體步驟如下：
[0200] 再加入滅菌去離子水至20μL。
[0201] PCR反應條件為：①預變性：94°C、4min;②PCR擴增共40個循環，前5個循環： 94°(：預變性3〇8、54°(：退火4〇8、72°(：延伸9〇8 ;中間五個：94°(：預變性3〇8、56°(：退火4〇8、 72°C延伸90s;最后30個循環：94°C預變性30s、60°C退火40s、72°C延伸90s;③72°C充分 延伸10min，反應結束。
[0202] 將PCR擴增產物進行質量分數1 %瓊脂糖凝膠電泳（結果見圖6)，然后用上海生 工生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA回收試劑盒純化回收，并置于-20°C保存備用。 圖6結果表明，PCR擴增產物的片段大小約為1044bp，與預期目的片段大小相符。
[0203] 實施例4重組質粒pEGEP-Nl_p53的構建
[0204] 重組質粒pEGEP-Nl_p53的構建流程示意圖參見圖7。
[0205] 1、重組質粒pMD18-T-p53和載體pEGFP-Nl的提取、酶切及純化回收
[0206] 重組質粒pMD18-T-p53和載體pEGFP-Nl的提取，參照上海生工生物工程有限公司 的SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒。其中載體pEGFP-Nl的圖譜見圖8。
[0207] 將重組質粒pMD18-T_p53和載體pEGFP-Nl同時進行雙酶切，參照Takara公司內 切酶的使用說明書。
[0209] 酶切體系總體積均為80μL，30°C酶切4h;酶切產物質量分數1. 0%的瓊脂糖凝膠 電泳鑒定酶切產物并純化回收。
[0210] 質量分數1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，在凝膠成像系統中觀察電泳條帶，電泳 條帶與目的片段的大小基本一致，對目的條帶P53和載體pEGFP-Nl酶切產物進行純化回 收。具體操作步驟嚴格參照上海生工生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA回收試劑盒說 明書操作。
[0211] 2、連接產物pEGEP-Nl_p53的構建
[0212] 將純化回收的人抑癌基因p53和載體pEGFP-Nl酶切產物進行連接。
[0214] 補加滅菌去離子水至總體積為20μL，將上述溶液混勻，20°C連接5h。
[0215] 3、連接產物pEGEP-Nl_p53的轉化
[0216] 連接產物pEGEP-Nl-p53的轉化方法參照實施例2中的連接產物pMD18-T-p53的 轉化方法。
[0217] 4、連接產物pEGEP-Nl_p53的鑒定
[0218] (1)用滅過菌的白色槍頭挑取LB平板上的單個菌落于含有lmLLB液體培養基的 1. 5mL的離心管中；
[0219] (2)將離心管放入37°C培養箱中，培養4~5h;
[0220] (3)以培養4~5h的菌液為模板做菌液PCR，檢測單菌落是否為陽性菌落（結果 見圖9)。
[0221] 連接產物pEGEP-Nl_p53進行PCR檢測，
[0223] 加滅菌去離子水補充至總體積20μ L。反應條件