一種提高轉基因雞孵化率的方法及使用的蛋殼開口器的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種提高轉基因雞孵化率的方法，同時還涉及該方法使用的蛋殼開口 器，屬于生物基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 細胞轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和 細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。雞 具有世代周期短、低成本、繁殖力高、卵中天然存在著蛋白酶抑制劑和良好的無菌環境，表 達的重組蛋白易提純、效益高等優點，因此轉基因雞的研究是目前科學研究的熱點和生物 制藥領域的新興產業之一。胚盤顯微注射法是制備轉基因雞的常用手段，其中雞蛋開窗法 是雞胚盤顯微注射法的的關鍵技術之一，它在很大程度上決定了轉基因雞的孵化率。胚盤 顯微注射法必須在種蛋上打開一個小窗，這就無可避免的破外了雞蛋外殼的正常結構，改 變了蛋殼內外的壓力平衡和雞胚發育的內環境，從而造成雞胚的非正常死亡。同時，開窗處 理使蛋殼受損，極易造成雞胚受到污染，大大降低了孵化率。因此，研發出一種行之有效的 提高轉基因雞孵化率的方法具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是提供一種提高轉基因雞孵化率的方法及使用的蛋 殼開口器，能夠有效提高轉基因雞的孵化率。
[0004]為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是提供一種提高轉基因雞孵化率的 方法，包括以下步驟：
[0005] (1)孵化器的消毒及種蛋的預孵化處理
[0006] 對孵化器進行消毒，種蛋進行預孵化處理，放入孵化箱內開始孵化；l-18d的孵化 溫度為37. 8°C，濕度為60%，19-21d的孵化溫度為37°C，濕度為78% ;
[0007] (2)種蛋的開口
[0008] 開口前將蛋殼開口器和無菌操作臺進行消毒，將孵化12-24h的種蛋從孵化箱內 取出，在種蛋的赤道位置先用碘酊后用75%酒精擦拭消毒，用砂輪在蛋殼赤道面處研磨，一 邊研磨一邊用酒精棉球擦拭蛋殼碎末，直至蛋殼赤道面上出現開口，觀察雞胚孵育情況；
[0009] (3)外源基因的注射
[0010] 將開口后的雞蛋，開口向上，放在操作臺內靜置2min，使雞胚盤的位置漂浮在雞蛋 的開口處，將含有外源基因的轉染液注射入雞的胚盤中，用抗生素對開口處進行殺菌；
[0011] ⑷種蛋的封口
[0012] 種蛋的封口采用蛋清+蛋殼膜封口的方法，封口后放入孵化箱繼續孵化；其中蛋 清+蛋殼膜封口的方法為：將蛋殼膜在蛋清中潤洗，然后在開口處覆蓋第一層蛋殼膜，再在 第一層蛋殼膜上交叉覆蓋第二層蛋殼膜。
[0013] 優選的，第一層蛋殼膜和第二層蛋殼膜呈十字形交叉覆蓋。
[0014] 步驟⑴中孵化器的消毒方法為：將孵化器進行清洗，關閉進出氣孔和風機，按照 每立方米空間高錳酸鉀l〇g，福爾馬林15mL的比例依次加入高錳酸鉀和福爾馬林，混合，當 混合溶液冒煙時，關閉孵化器門，消毒lh，消毒溫度為15-20°C，濕度彡75%;
[0015] 步驟⑴中種蛋的預孵化方法為：將新潔爾滅和水按照質量比1:1000的比例配制 成新潔爾滅溶液，其中水溫為30°C，將種蛋浸入新潔爾滅溶液中5min，洗凈，取出，用脫脂 棉擦拭干凈。
[0016] 步驟（3)中抗生素的制備方法：將青鏈霉素加入生理鹽水中，使其終濃度為 〇· 1μg/μL〇
[0017] 所述外源基因為表達載體pEGFP-Nl-p53/MAR，是將人抑癌基因p53和雞的核基質 附著區MAR基因插入表達載體中構建而成，包括如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0018] 所述表達載體pEGFP-Nl_p53/MAR的構建方法，包括以下步驟：
[0019] (1)抽取癌癥病人的外周血液，提取外周血液總RNA，設計上下游引物Primera、 Primerb，RT-PCR擴增人抑癌基因p53,瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物并純化回收；
[0020] RT-PCR反應體系為：2XPCR Buffer 22 yL，上下游引物各1. 5 yL，RT/Taq Master Mix 2 μL，總RNA模板 3μL ;
[0021] RT-PCR反應條件為：①cDNA合成和預變性：40°C、30min，94°C、2min;②PCR擴增 共40個循環：94°C預變性30s、前5個循環65°C退火30s，后35個循環68°C退火30s、72°C 延伸90s;③72°C充分延伸lOmin，反應結束；
[0022] (2)將質粒PMD18-T與人抑癌基因p53 16 °C連接過夜，得到連接產物 pMD18-T-p53 ;將連接產物pMD18-T-p53轉化感受態細胞，培養，根據上下游引物Primera、 Primerb，挑取單菌落進行PCR檢測，篩選出陽性菌落，提取連接產物pMD18-T-p53,再進行 酶切鑒定和測序鑒定，鑒定正確的為重組質粒pMD18-T-p53 ;
[0023] 所述連接的反應體系為：人抑癌基因p53 8 μL、質粒pMD18_T 2 μL、solution I 10 yL；
[0024] (3)提取雞肝臟組織中的DNA，設計上下游引物Primerc、Primerd，PCR擴增雞 MAR基因，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物并純化回收；
[0025]所述PCR的反應體系為：10X PCR Buffer 3 μL、dNTP Mixture 2 μL、總DNA模板 1.5 μL、上下游引物各1μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL，加滅菌去離子水補充至總體積20μL ;
[0026] 所述PCR的反應條件為：①預變性：94°C、4min;②PCR擴增共40個循環，前5個 循環：94°C預變性30s、54°C退火40s、72°C延伸90s;中間五個：94°C預變性30s、56°C退火 4〇8、72°(：延伸9〇8;最后3()個循環：94°(：預變性3〇8、60°(：退火4〇8、72°(：延伸9〇8 ;@721€ 充分延伸l〇min，反應結束；
[0027] (4)將重組質粒pMD18-T-p53和載體pEGFP-Nl分別用HindIII和BamHI限制 性內切酶雙酶切，純化回收人抑癌基因P53和載體pEGFP-Nl酶切產物，20°C連接5h，得 到連接產物pEGEP-Nl-p53;將連接產物pEGEP-Nl-p53轉化感受態細胞，培養，根據上下 游引物Primera、Primerb，挑取單菌落進行PCR檢測，篩選出陽性菌落，提取連接產物 pEGEP-Nl-p53,再進行酶切鑒定和測序鑒定，鑒定正確的為重組質粒pEGEP-Nl-p53;
[0028]所述雙酶切的反應體系為：重組質粒pMD18-T-p53或載體pEGFP-Nl20μL、 Buffer Κ5μL、滅菌去離子水 51μL、Hind III和BamH I各 2μL;30°C酶切 4h;
[0029] 所述連接的反應體系為：人抑癌基因p53 5μL、載體pEGFP-Nl酶切產物1μL、T4 連接酶lyL、10XT4DNALigaseBuffer2.5yL，補加滅菌去離子水至總體積為20yL;
[0030] (5)將重組質粒pEGEP-Nl-p53與MAR基因分別Xbal和Notl限制性內切酶雙酶 切，純化回收后25°C連接3h，得到連接產物pEGEP-Nl-p53/MAR;將連接產物pEGEP-Nl-p53/ MAR轉化感受態細胞，培養，根據引物Primera、Primerb、Primerc、Primerd，挑取單菌落 進行PCR檢測人抑癌基因p53和MAR基因，篩選出陽性菌落，提取連接產物pEGEP-Nl-p53/ MAR，進行酶切鑒定，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序，酶切檢測及測序正確的即 為表達載體pEGFP-Nl-p53/MAR;
[0031] 雙酶切的反應體系為：重組質粒pEGEP_Nl_p53 3μL、BufferO1μL、滅菌去離子 水 13μL、Xbal和Notl各L5μL;30°C反應 4h;
[0032] 所述連接的體系為：MAR基因3yL、重組質粒pEGEP-Nl-p53 2yL、T4連接酶 0.5yL、10XT4DNALigaseBuffer3yL;加滅菌去離子水至總體積 20yL。
[0033] 所述上下游引物Primera、Primerb為：
[0034]Primera:5'-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTC-3'
[0035]Primerb:5'-CGCGGATCCCAGTCTGAATCAGGCCCT-3'
[0036] 所述上下游引物Primerc、Primerd為：
[0037]Primerc:5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'
[0038]Primerd:5'-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3' 〇
[0039]步驟（2)、（4)、（5)中的PCR檢測的反應體系為：10XPCRBuffer3yL、dNTP Mixture2yL、菌落菌液1. 5yL、上下游引物各1yL、TaqDNA聚合酶0. 5yL，加滅菌去離子 水補充至總體積20μL;
[0040]步驟⑵、⑷和（5)中人抑癌基因p53的PCR檢測的反應條件為：①94°C預變性 5min;②PCR擴增共40個循環：94°C預變性30s、60°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分 延伸lOmin;
[0041] 步驟（5)中MAR基因PCR檢測的反應條件為：①94°C預變性5min;②PCR擴增共 40個循環：94°C預變性30s、54°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸lOmin。
[0042] 步驟（2)、（5)中的酶切鑒定的反應體系為：連接產物6μL、10XBufferK3μL、 滅菌去離子水8μL、HindIII和BamHI各1. 5μL，30°C反應4h;
[0043] 步驟（4)中的酶切鑒定的反應體系為：連接產物8yL、10XBufferK5yL、滅菌 去離子水 15μL、HindIII2μL，30°C反應 4h。
[0044] 步驟（5)中酶切后的重組質粒pEGEP-Nl-p53與MAR基因的純化回收方法為：
[0045] (1)取 15μL重組質粒pEGFP-Nl-p53 的溶液，加入 3μL4mol/L的NaAc和 55μL 無水乙醇分析純沉淀DNA;
[0046] 取MAR基因的PCR產物30μL，加入6μL4mol/L的NaAc和110μL的無水乙醇分 析純沉淀DNA;
[0047] (2) 10000r/min離心5min，棄上清，在重組質粒pEGFP_Nl_p53和MAR基因中分別 加入100μL和150μL質量分數75 %的乙醇沖洗一次；
[0048] (3)重復步驟⑵一次；
[0049] (4) 10000r/min離心 5min，棄上清，室溫下干燥 5-10min;
[0050] (5)向重組質粒pEGFP-Nl-p53和MAR基因的離心管中分別加入10yL和20yL的 滅菌