面，可W產生表達一種具有殺有害生物活性的殺有害生物蛋白 的轉基因植物。W上通過實例來說明的方法可用于產生轉基因植物，但產生運些轉基因植 物細胞的方式對于本發明而言不是至關重要的。可W依據實驗者的判斷來使用在本領域已 知或描述的方法，如±壤桿菌介導的轉化、生物射彈轉化W及非粒子介導法。可W通過在本 領域內所說明的普通方法來分離表達一種殺有害生物蛋白的植物，運些方法例如通過愈傷 組織的轉化、轉化的愈傷組織的選擇、W及從此類轉基因愈傷組織中再生出能育的植物類。 在此類方法中，可W使用任何基因作為選擇標記，只要它在植物細胞中的表達賦予了鑒定 或選擇轉化的細胞的能力。
[0086] 已經開發了多種與植物細胞一起使用的標記物，如對于氯霉素、氨基糖武G418、 潮霉素、W及類似物的抗性。編碼參與葉綠體代謝的產物的其他基因也可W用作選擇標 記。例如，提供對于植物除草劑（如草甘憐、漠苯臘、或咪挫琳酬）的抗性的基因可W具 有特別的用途。運樣的基因已經被報道（斯托克（Sta化er)等人（1985)生物化學雜志 263:6310-6314(漠苯臘抗性臘水解酶基因）；W及薩塔西瓦姆（Sathasivan)等人（1990) 核酸研究18:2188(AHAS咪挫嘟酬抗性基因）。另外，在此披露的運些基因作為評估細菌 細胞或植物細胞的轉化的標記是有用的。用于檢測在植物、植物器官（例如，葉子、莖、根、 等）、種子、植物細胞、繁殖體、胚或它們的子代中轉基因的存在的方法是本領域內所熟知 的。在一個實施例中，通過測試殺有害生物活性來檢測轉基因的存在。
[0087] 可W針對殺有害生物活性來測試表達一種殺有害生物蛋白的能育植物，并且選擇 顯示出最佳活性的植物W用于進一步的育種。在本領域內對有害生物活性進行測定的方 法是可供使用的。通常，在攝食測定中混合并使用了運種蛋白質。參見，例如馬羅內等人 (1985)經濟昆蟲學雜志78:290-293。
[0088] 本發明可W用于轉化任何植物種類，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。感 興趣的植物的實例包括但不限于：玉米（corn)(玉米（maize))、高梁、小麥、向日葵、番茄、 十字花科植物、胡椒、馬鈴馨、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘薦、煙草、大麥、W及油菜、蕓苔屬植 物、首猜、黑麥、粟、紅花、花生、甘馨、木馨、咖啡、挪子、渡蘿、相枯屬的樹、可可、茶、香蕉、鱷 梨、無花果、番石惱、芒果、橄攬、番木瓜、腰果、澳洲堅果、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞性植物、W 及針葉樹。 柳例蔬菜包括但不限于：番茄、窩宦、青豆、利馬豆、魏豆，W及甜瓜屬（genus化rcumis)的成員，如黃瓜、網紋甜瓜、W及甜瓜。觀賞性植物包括但不限于：杜酷花屬、繡 球屬、木穫屬、菩薇屬、郁金香、水仙屬、碧冬茄屬、康乃馨、一品紅、W及菊花。優選地，本發 明的植物是作物（例如玉米、高梁、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴馨、棉花、 稻、大豆、甜菜、甘薦、煙草、大麥、油菜巧油菜等）。
[0090] 在有害牛物梓制方而的用旅
[0091] 在有害生物控制或工程化處理其他生物中用于采用多種菌株作為殺有害生物劑 的總體方法在本領域內是已知的，運些菌株包括本發明的一種核巧酸序列或它的一種變 體。參見，例如，美國專利號5, 039, 523和EP0480762A2。
[0092] 包含本發明的核巧酸序列或其變體的芽抱桿菌菌株、或已經被遺傳改變而包含本 發明的殺有害生物基因和蛋白質的微生物可W用于保護農業作物W及產品免受有害生物 的侵害。在本發明的一個方面，用W下試劑來處理一種產生毒素（殺有害生物劑）的生物 的完整的（即，未裂解的）細胞，當運些細胞被施用到一種或多種目標有害生物的環境中時 運些試劑延長了在該細胞中產生的毒素的活性。
[0093] 可替代地，通過將殺有害生物基因引入到細胞宿主中來產生該殺有害生物劑。該 殺有害生物基因的表達直接或間接地導致了該殺有害生物劑的細胞內產生和維持。在本發 明的一個方面，然后在W下條件下對運些細胞進行處理，當該細胞被施用到一種或多種目 標有害生物的環境時運些條件延長了在該細胞中產生的毒素的活性。得到的產物保留該毒 素的毒性。然后，可W按照常規技術來配制運些天然膠囊化的殺有害生物劑，W用于施用到 寄宿著一種目標有害生物的環境（例如，±壤、水、W及植物的葉）。參見，例如EPA0192319 W及其中所引用的文獻。可替代地，可配制表達本發明的基因的運些細胞，例如W便允許得 到的材料作為一種殺有害生物劑的施用。
[0094] 本發明的活性成分通常W組合物的形式進行施用，并且可W同時或相繼地與其他 化合物一起施用到有待處理的作物區域或植物中。運些化合物可W是肥料、除草劑、冷凍 保護劑（ciToprotectants)、表面活性劑、洗涂劑、殺有害生物肥皂（pesticidalsoap)、休 眠噴灑油（dormantoil)、聚合物、和/或定時釋放或生物可降解載體配制品，運些配制品 允許在單次施用該制劑之后對目標區域進行長期給藥。它們還可W是選擇性除草劑、化學 殺昆蟲劑、殺病毒劑、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺有害生物劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲 劑、殺軟體動物劑或運些配制品中的幾種的混合物，如果希望的話，與其他農業上可接受的 載體、表面活性劑或在配制品領域內通常采用的促進施用的佐劑一起。合適的載體和佐劑 可W是固體或液體，并且相應于在配制技術中常常采用的物質，例如天然的或再生的礦物 質、溶劑、分散劑、濕潤劑、增粘劑、粘合劑或肥料。同樣地，可將運些配制品制備成可食用的 "誘巧"或塑造成有害生物"陷阱"W允許由一種目標有害生物來攝食或攝取該殺蟲配制品。 陽〇巧]施用本發明的活性成分或本發明的農業化學組合物（該組合物包括由本發明的 細菌菌株所產生的運些殺有害生物蛋白中的至少一種）的方法包括葉施用、種子涂覆和± 壤施用。施用次數W及施用率取決于由相應的有害生物所侵染的強度。
[0096] 可W將該組合物配制成一種粉末、粉劑、小丸、顆粒、噴霧劑、乳液、膠體、溶液、或 類似劑型，并且可W通過W下常規方法來制備該組合物，運些方法例如將包括該多膚的細 菌細胞的培養物干燥、冷凍干燥、均質化、提取、過濾、離屯、、沉降、或濃縮。在包含至少一種 運種殺蟲多膚的所有此類組合物中，該多膚可W按照按重量計從大約1%至大約99%的濃 度而存在。
[0097]可W在一個給定的區域內通過本發明的運些方法來殺死銷翅目有害生物或減少 其數目，或可W將它們預防性地施用到一個環境區域內W防止由一種易受影響的有害生物 的侵染。優選地，運種有害生物攝取、或接觸一個殺有害生物有效量的該多膚。"殺有害生 物有效量"是指該殺有害生物劑能夠引起至少一種有害生物的死亡、或明顯減少有害生物 的生長、攝食或正常生理發育的量。運個量將取決于W下因素而變化：例如，有待控制的特 定的目標有害生物；有待處理的特定的環境、地點、植物、作物、或農業場所；環境條件；W 及施用的殺有害生物有效的多膚組合物的方法、速率、濃度、穩定性、W及數量。運些制劑還 可W根據氣候條件、環境因素、和/或施用頻率和/或有害生物侵染的嚴重度而變化。
[0098] 可通過將該細菌細胞、晶體、和/或抱子懸浮物、或分離的蛋白組分與所希望的農 業上可接受的載體配制在一起來制備所說明的殺有害生物劑組合物。在施用之前，可W用 合適的手段（如凍干、冷凍干燥、干燥的，或在水性載體、介質或合適的稀釋劑，如鹽水或其 他緩沖液中）配制運些組合物。運些經配制的組合物可W處于W下形式：粉劑或顆粒材料、 或在油（植物性或礦物性）中的懸浮體、或水或油/水乳液、或作為可濕性粉末、或與適合 于農業施用的任何其他載體材料相組合。適合的農業載體可W是固體或液體并且在本領域 是熟知的。術語"農業上可接受的載體"覆蓋了所有佐劑、惰性組分、分散劑、表面活性劑、 增粘劑、粘合劑、等等，它們在殺蟲劑配制技術中是常用的；運些對于殺蟲劑配制領域的普 通技術人員而言是熟知的。運些制劑可W與一種或多種固體或液體佐劑相混合，并且通過 不同的手段進行制備，例如通過使用常規的配制技術將運種殺有害生物組合物與合適的佐 劑進行均勻地混合、滲合和/或研磨。合適的制劑和施用方法說明于美國專利號6, 468, 523 中，該文獻通過引用結合在此。
[0099] "銷翅目有害生物"包括但不限于玉米根蟲有害生物，例如，西方玉米根蟲 (Westerncornrootworm)(例如，西方玉米根蟲值i油；roticavirgiferavirgifera))、北 方玉米根蟲（No;rthe;rncornrootworm)(例如，北方玉米根蟲值i油；roticabarberi))W 及南方玉米根蟲（例如，黃瓜十一星葉甲食根亞種）。 WOO]用于蠟加植物產量的方法 陽101] 提供了用于增加植物產量的方法。運些方法包括提供表達一種編碼在此披露的殺 有害生物多膚序列的多核巧酸的植物或植物細胞并且在被有害生物侵染（或者易受到該 有害生物侵染）的田地中使該植物或其種子生長，所述多膚具有針對該有害生物的殺有害 生物活性。在一些實施例中，在此描述的Axmil84多膚具有針對銷翅目有害生物的殺有害 生物活性，并且所述大田被所述銷翅目有害生物侵染。在不同實施例中，該銷翅目有害生物 是玉米根蟲有害生物，如西方玉米根蟲。如本文所定義的，該植物的"產量"指由該植物所產 生的生物質的品質和/或數量。"生物質"一詞是指任何經測量的植物產物。生物質產生的 增加是在所測量的植物產物的產量方面的任何改進。增加植物產量具有幾種商業應用。例 如，增加植物葉生物質可W增加用于人或動物消費的葉菜的產量。另外，增加葉生物質可W 用于增加植物衍生的藥學或工業產物的生產。產量的增加可W包括與一種不表達該殺有害 生物序列的植物相比任何統計學上顯著的增加，包括但不限于：產量的至少1%的增加，至 少3%的增加，至少5%的增加，至少10%的增加，至少20%的增加，至少30%、至少50%、 至少70%、至少100%或更大的增加。在多種特定方法中，植物產量由于植物表達在此披露 的一種殺有害生物蛋白而獲得改進的有害生物抗性而增加。該殺有害生物蛋白的表達導致 有害生物侵染或攝食的能力減小。
[0102] 還可W用一種或多種化學成分來處理植物，運些化學成分包括一種或多種除草 劑、殺有害生物劑、或殺真菌劑。示例性的化學成分包括:水果/蔬菓類除草巧I:泰去津、 除草定、敵草隆、草甘麟、利谷隆、嗦草酬、西瑪津、氣樂靈、化氣禾草靈、草下麟、氯化喀橫隆 (Gowan)、百草枯、戊烘草胺、締禾晚、氣丙喀草醋、氯化喀橫隆、Ξ嗦巧草胺（Indaziflam); 果連/蔬菓類殺昆蟲巧I:涕滅威、蘇云余芽前桿蔭度acillusthuriengiensis)、甲糞威 (Carba巧 1)、克百威（Carbofuran)、毒死婢（Qilo;rpy;rifos)、氯氯菊醋（切permet虹in)、 漠氯菊醋值eltamet虹in)、阿維菌素（Abamectin)、氣氯氯菊醋/β-氣氯氯菊醋、高氯戊 菊醋、λ-氣氯氯菊醋、滅蛾釀、聯苯阱醋、甲氧蟲酷阱、雙苯氣脈、環蟲酷阱、嚷蟲嘟、巧蟲 胺、喀蛾醋、螺蛾醋、丫-氣氯氯菊醋、螺甲蛾醋、多殺菌素、氯蟲酷胺、氯蟲酷胺、殺鈴脈、 螺蟲乙醋、化蟲嘟、氣蟲酷胺、硫雙威燈hiodicarb)、氯氣蟲腺、諷蟲晚、下氣蛾醋、臘化蛾 醋（切anopyrafen)、嚷蟲胺、嚷蟲嗦、乙基多殺菌素（Spinotoram)、硫雙威（Thiodicarb)、 氣晚蟲酷胺、甲硫威、因滅汀-苯甲酸鹽（Emamectin-benzoate)、巧蟲威、苯線憐、化丙 酸、苯下錫氧化物:果連/蔬菜類殺真蔭巧I:畔略蔭胺(Ametoctradin)、喀菌醋、苯嚷菌胺 (Benthiavalicarb)、晚酷菌胺、克菌丹、多菌靈、百菌清、銅、氯霜挫、環氣菌胺、霜脈氯、環 挫醇、喀菌環胺、惡酸挫、達滅芬值imetomo巧h)、二氯蔥釀、咪挫菌酬、環酷菌胺、氣晚胺、咯 菌臘、氣化菌胺、氣化菌酷胺、氣喀菌醋、氣挫菌酷胺（Fluxapyroxad)、滅菌丹、Ξ乙麟酸、 異菌脈、丙森鋒、異皮姆（Isopyrazam)、酸菌醋、代森儘鋒、雙烘酷菌胺（Mandipropamid)、 甲霜靈/精甲霜靈、代森聯、苯菌酬、臘菌挫、戊菌挫、化嚷菌胺、晚氧菌醋、霜霉威、丙環 挫、丙森鋒、丙氧哇嘟、丙硫菌挫、挫菌胺醋、喀霉胺、哇氧靈、螺環菌胺、硫、戊挫醇、甲基硫 菌靈、朽菌醋:谷類除草劑：2.4-D、醜略碼陳(Amidosulfuron)、漠苯臘、氣酬挫草-E、綠 麥隆、氯橫隆、烘草醋憐、二氯化晚酸、麥草畏、禾草靈-M、化氣草胺、精嗯挫禾草靈、化氣 草胺、氣卡己腺鋼、氣嚷草胺、禾草靈HVKFlupyrosul化ron-M)、氯氣化氧乙酸、巧草酬、草 甘麟、艦橫隆、艦苯臘、異丙隆、MCPA、甲橫胺橫隆、甲橫隆、二甲戊樂靈、挫嘟草醋、丙苯、 節草丹、氣橫隆、橫酷橫隆、嚷吩橫隆、朽草酬、酸苯橫隆、苯橫隆、氣樂靈、甲橫隆;谷類殺 真蔭巧I:嗦蔭酷、聯苯冊蔭眩度ixafen)、晚酷菌胺、多菌靈、百菌清、環氣菌胺、環挫醇、 喀菌環胺、酸菌胺、氣環挫、苯誘、下苯嗎嘟、氣化菌酷胺、氣喀菌醋、氣哇挫、氣挫菌酷胺 (F1uxapyroxad)、異皮姆、酸菌醋、葉菌挫、苯菌酬、化嚷菌胺、晚氧菌醋、咪鮮胺、丙環挫、丙 氧哇嘟、丙硫菌挫、挫菌胺醋、哇氧靈、螺環菌胺、戊挫醇、甲基硫菌靈、朽菌醋:谷類殺昆蟲 寬U樂果、λ-S氣氯氯菊醋化ambda-cyhalthrin)、漠氯菊醋、順式氯氯菊醋、β-氣氯氯 菊醋、聯苯菊醋、化蟲嘟、嚷蟲胺、嚷蟲嗦、嚷蟲嘟、晚蟲脈、巧蟲胺值ineto化ran)、毒死婢 (Clo;rphy;ri地0S)、抗曬威、滅蟲威、氣晚蟲胺臘（Sulfoxaflor);玉蜀泰除草劑：泰去津、甲 草胺、漠苯臘、乙草胺、麥草畏、二氯化晚酸、（S-)甲酪嚷草胺、草錠麟、草甘麟、異嗯挫草酬、 (S-)異丙甲草胺、甲基橫草酬、煙喀橫隆、氣喀橫隆、諷喀橫隆、橫草酬、甲酯胺橫隆、苯化挫 草酬（Topramezone)、環橫酬（Tembotrione)、喀晚朽草酸、酬脈橫草吩醋、氣嚷草胺、化咯 橫隆（Pyroxasulfon):玉蜀泰殺昆蟲巧I:巧百威、毒死贓、聯苯菊酷、氣蟲臘、冊蟲腑、λ-氯 氣氯菊醋、屯氣菊醋、特下硫憐、嚷蟲嗦、嚷蟲胺、蛾醋、氣蟲酷胺、殺蟲脈、氯蟲酷胺、漠氯 菊醋、硫雙威、β-氣氯氯菊醋、氯氯菊醋、聯苯菊醋、風蛾脈、喀丙憐（Tebupirimphos)、 乙蟲臘、氯蟲酷胺（切azypyr)、嚷蟲嘟、晚蟲脈、巧蟲胺(Dineto化ran)，阿維菌素；玉蜀 泰殺真蔭巧I:嗦蔭酷、聯苯冊蔭眩度ixafen)、晚酷菌胺、環挫醇、酸菌胺、氣環挫、種衣醋 (^nitropan)、氣化菌酷胺、氣喀菌醋、氣挫菌酷胺（Fluxapyroxad)、異皮姆、葉菌挫、化嚷 菌胺、晚氧菌醋、丙環挫、丙硫菌挫、挫菌胺醋、戊挫醇、朽菌醋:水稻除草巧I:下草眩、敵禪、 四挫喀橫隆、節喀橫隆、氯氣草醋、殺草隆、四挫酷草胺、咪挫橫隆、苯嚷草