Axmi184用于防治根蟲昆蟲的用圖
【專利說明】ΑΧΜ1184用于防治根蟲昆蟲的用途
[0001] 對W電子方式提交的序列表的參考
[0002] 所述序列表的官方副本經由EFS-Web作為ASCn格式序列表W電子方式提交，文 件名為"APA136001SEQLIST.txt"，創建于2013年1月16日，并且具有14千字節大小，并且 與本說明書同時提交。包含在運一ASCn格式文件中的序列表是本說明書的一部分并且通 過引用W其全部內容結合在此。 發明領域
[0003] 本發明設及分子生物學領域。提供了編碼殺有害生物蛋白的新穎的基因。運些蛋 白和編碼它們的核酸序列在制備殺有害生物配制品中W及在生產轉基因抗有害生物植物 中是有用的。
[0004] 發明背景 陽0化]玉米根蟲是一種重要的農業有害生物。西方玉米根蟲（Westerncornrootworm/Di油roticavirgiferavirgifera)是在北美最具破壞性的玉米根蟲種類之一，尤其是在 中西部玉米種植區，如愛荷華州。玉米根蟲幼蟲和成蟲兩者都可W損害玉米植物。剛解出 的幼蟲主要攝食根毛和外根組織。隨著幼蟲成長和其食物需求增加，它們鉆進根中進行攝 食。通常，幼蟲損害在次生根系統很好地建立并且支柱根正在形成之后是最嚴重的。根尖 將出現褐色并且經常挖隧道進入并巧嚼回到植物的基部。可W發現幼蟲挖隧道進入較大的 根中并且偶爾進入植物冠部。已經使用作物輪作、早期種植策略、殺昆蟲劑W及表達針對根 蟲的毒素的轉基因植物來嘗試防治其群體。
[0006] 在2010年，在全世界超過5800萬公頃種植被工程化為產生來源于細菌蘇云 金芽抱桿菌度t)的殺昆蟲毒素的轉基因作物（James(詹姆斯）C(2010)GlobalStatus ofCommercializedBiotech/GMCrops: 2010 (商業化的生物技術/GM作物的全球地位： 2010)，ISAAA簡號42,伊薩卡（Ithaca),紐約JSAAA)。化作物的益處包括減少使用有 害的殺昆蟲劑和一些關鍵的農業有害生物的區域抑制（Carriere(卡里爾）等人（2003) Proc化tlAcadSciUSA(美國國家科學院院刊）100:1519-1523;Cattaneo(卡塔內奧） 等人（2006)美國國家科學院院刊103:7571-7576 ;Huang(黃）等人（2005)Science(科 學）308:688-690 ;Wu(吳）（2008)科學 321:1676-1678 ;W及Hutchison(哈欽森）等人 (2010)科學330:222-225)。西方玉米根蟲玉米根蛋葉甲（銷翅目：葉甲科）在美國境內屬 于玉蜀泰的最嚴重的有害生物，其中幼蟲攝食玉蜀泰根導致來自運種有害生物的大部分的 作物損失。從2003年開始，化玉蜀泰被商業化為防治西方玉米根蟲幼蟲并且迅速被農民 采用，在2009年期間在美國構成超過45 %的玉蜀泰作物（James(詹姆斯）C(2009)Global StatusofCommercializedBiotech/GMCrops: 2009 (商業化的生物技術/GM作物的全球 地位：2009)，ISAAA簡號41，伊薩卡，紐約：ISAAA;環境保護署巧nvironmentalProtection Agency)(2003)Biopesticidesregistrationactiondocument:eventM0N863Bacillus thuringiensis化y3抓1Corn(生物殺有害生物劑注冊行為文件：事件M0N863蘇云金芽抱 桿菌化y3Bbl玉米））。
[0007] 在美國及其他地方使用庇護策略，W延遲有害生物對化作物的抗性（Gould(古爾 德）F(1998)AnnuRev化tomol(昆蟲學年評）43:701-72)。運種策略使用非化宿主植物 作為化敏感基因型的庇護物。然而，西方玉米根蟲已經反復地證明了它適應有害生物管理 策略的能力（Gray(格雷）等人（2009)AnnuRev化tomol(昆蟲學年評）54:303-321)。實 例包括對常規殺昆蟲劑和作物輪作栽培技術的抗性的進化（Meinke(梅恩克）等人（1998) JEcon化tomol(經濟昆蟲學雜志）91:594-600;Parimi(帕拉米）等人（2006)經濟昆蟲學 雜志 25:269-274;Levine(萊文）等人（2002)Amaitomol(美國昆蟲學）48:94-107)。另 夕F，Gassmann(加斯曼）等人（2011，化oS0肥6(7):e22629)最近報道由農民鑒定為對化 玉蜀泰具有嚴重的根蟲攝食損傷的大田在實驗室生物檢測中包含在化y3Bbl玉蜀泰上展 示出顯著高于來自不與運樣的攝食損傷相關的大田的西方玉米根蟲的存活的西方玉米根 蟲群體。 陽00引發明概述
[0009] 在此提供了用于賦予針對細菌、植物、植物細胞、組織W及種子的殺有害生物活性 的組合物和方法。具體而言，提供了用于殺死或防治銷翅目有害生物群體，特別是玉米根蟲 有害生物群體的方法。運些方法包括使該銷翅目有害生物與殺有害生物有效量的包含銷 翅目毒素，特別是玉米根蟲毒素的多膚接觸。在不同實施例中，該銷翅目毒素包括SEQID N0:3的氨基酸序列或其殺有害生物有效的變體或片段。在一些實施例中，用于保護植物或 其細胞免受銷翅目有害生物群體，特別是玉米根蟲有害生物侵害的方法包括在植物或其細 胞中表達編碼SEQIDN0:3的核酸或其變體或段，其中該核酸被可操作地連接至能夠指導 該核酸在植物細胞中的表達的啟動子上。
[0010] 進一步包括用于增加植物產量的方法，運些方法包括在大田中種植一種已經穩定 地在其基因組中滲入DNA構建體的植物或其種子，該構建體包括一種可操作地連接至啟動 子上的核酸，該啟動子能夠指導該核酸在植物細胞中的表達，其中該核酸編碼SEQIDNO:3 或其殺有害生物有效的變體或片段。
[0011] 本發明的運些組合物和方法用于產生具有增強的有害生物抗性或耐受性的生物。 運些生物W及包括運些生物的組合物對于農業目的是所希望的。
[0012] 附圖簡述
[001引圖1示出了Axmil84在減少由西方玉米根蟲造成的根損害方面的有效性。
[0014] 詳細說明
[0015] 本發明描繪了用于調節生物（特別是植物或植物細胞）中的有害生物抗性或耐受 性的方法。"抗性"一詞是指該有害生物（例如，昆蟲）一旦攝取或W其他方式接觸本發明 的多膚類時就被殺死。"耐受性"一詞是指該有害生物的運動、攝食、繁殖、或其他功能的損 害或降低。運些方法設及用編碼本發明的一種殺有害生物蛋白的核巧酸序列來轉化生物。 具體地說，本發明的核巧酸序列用于制備具有殺有害生物活性的植物和微生物。在此描述 的運些方法對于防治或殺死銷翅目有害生物群體和用于產生具有針對銷翅目有害生物的 殺有害生物活性的組合物是有用的。
[0016]"殺有害生物毒素"或"殺有害生物蛋白"是指針對一種或多種銷翅目有害生 物具有毒性的毒素，運些銷翅目有害生物包括但不限于，西方玉米根蟲（Westerncorn rootworm)(例如，西方玉米根蟲值i油；roticavirgiferavirgifera))、北方玉米根蟲 (No;rthe;rncornrootworm)(例如，北方玉米根蟲值i油；roticabarberi))和南方玉米根蟲 (例如，黃瓜^ 星葉甲食根亞種值i油；roticaundecimpunctatahowardi))有害生物，或 與運樣的一種蛋白具有同源性的蛋白。殺有害生物蛋白包括從在此披露的全長核巧酸序列 中推導出的氨基酸序列、W及比運些全長序列更短的氨基酸序列（或者由于使用了可替代 的下游起始位點、或者由于產生較短的具有殺有害生物活性的蛋白質的加工過程）。加工可 W在表達該蛋白質的生物內發生，或在該有害生物攝取該蛋白質之后發生。 陽017] 在特定實施例中，該殺有害生物蛋白包括SEQIDN0:3中列出的Axmil84蛋白及 其變體和片段。
[0018] 因此，在此提供了用于殺死或防治銷翅目有害生物群體的方法，運些方法包括使 該有害生物與組合物接觸或將該有害生物暴露于組合物，該組合物包括本發明的殺有害生 物毒素。 分離的核酸分子、Pi及它們的巧體巧片段
[0020] 本發明的一個方面設及分離的或重組的核酸分子，運些核酸分子包括編碼殺有害 生物蛋白和多膚或它們的生物活性部分的核巧酸序列；W及足W用作雜交探針來鑒定編碼 具有序列同源性的區域的蛋白質的核酸分子的核酸分子。在此還涵蓋了能夠在如在此的其 他部分所定義的嚴格條件下與本發明的核巧酸序列雜交的核巧酸序列。如本文所使用的， 術語"核酸分子"旨在包括DNA分子（例如，重組DNA、cDNA或基因組DNA)和RNA分子（例 如，mRNA)化及使用核巧酸類似物而產生的DNA或RNA的類似物。該核酸分子可W是單鏈 的或雙鏈的，但優選地是雙鏈DNA。
[0021]"分離的"或"重組的"核酸序列（或DNA)被用在此處是指一種核酸序列（或DNA)， 該核酸序列（或DNA)不再存在于它的自然環境中（例如，在體外或在重組細菌或植物宿主 細胞中）。在一些實施例中，分離的或重組的核酸是不含有在衍生出該核酸的生物的基因 組DNA中天然地位于該核酸側翼的序列（即，位于該核酸的5'和3'末端的序列）（優選編 碼蛋白質的序列）。出于本發明的目的，"分離的"當用于指核酸分子時不包括分離的染色 體。例如，在不同實施例中，編碼δ-內毒素的分離的核酸分子可W包含小于約5化、地b、 3化、2化、化b、0. 5化或0. 1化的核巧酸序列，運些核巧酸序列天然地側翼于衍生出該核酸 的細胞的基因組DNA中的核酸分子。在不同實施例中，基本上不含細胞材料的δ-內毒素 蛋白包括具有低于約30%、20%、10%或5% (按干重計）的非δ-內毒素蛋白（在此也稱 為"污染性蛋白"）的蛋白制劑。 陽02引編碼本發明的蛋白質的核巧酸序列包括SEQIDNO: 1-2中列出的序列及其變體、 片段和互補物。"互補物"一詞是指核巧酸序列，該核巧酸序列與給定的核巧酸序列足夠地 互補，運樣使得它可W與該給定的核巧酸序列雜交W便由此形成穩定的雙鏈體。對于由運 些核巧酸序列所編碼的殺有害生物蛋白的相應氨基酸序列在SEQIDN0:3中列出。
[0023] 本發明還涵蓋了W下核酸分子，運些核酸分子是運些編碼殺有害生物蛋白的核巧 酸序列的片段。"片段"一詞是指編碼了殺蟲蛋白的核巧酸序列的一個部分。核巧酸序列 的片段可W編碼殺有害生物蛋白的生物活性部分，或者它可W是使用W下披露的方法可W 用作雜交探針或PCR引物的一個片段。作為編碼殺有害生物蛋白的核巧酸序列的片段的 核酸分子包括至少約 50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、 1350、1400個連續核巧酸，或達到在此所披露的全長的編碼殺有害生物蛋白的核巧酸序列 中存在的核巧酸的數目，運取決于所預期的用途。"相鄰的"一詞核巧酸旨在指彼此緊鄰的 核巧酸殘基。本發明的核巧酸序列的片段將編碼保留殺有害生物蛋白的生物活性、并且因 此保留殺有害生物活性的蛋白質片段。因此，還涵蓋了在此披露的多膚的生物活性片段。 "保留活性"一詞是指該片段將具有該殺蟲蛋白的至少約30%、至少約50%、至少約70%、 80%、90%、95%或更高的殺蟲活性。在一個實施例中，該殺有害生物活性是殺銷翅目活 性。在另一個實施例中，該殺有害生物活性是殺鱗翅目活性。在另一個實施例中，該殺有 害生物活性是殺線蟲活性。在另一個實施例中，該殺有害生物活性是殺雙翅目活性。在另 一個實施例中，該殺有害生物活性是殺半翅目活性。用于測量殺有害生物活性的方法在本 領域是熟知的。參見例如，Czapla(恰普拉）和Lang(朗）（1990)J.Econ.化tomol.(經濟 昆蟲學雜志）83:2480-2485 ;ArKlrews(安德魯斯）等人（1988)Biochem.J.(生物化學雜 志）252:199-206sMarrone(馬羅內）等人（198f5)J.ofEconomiclintomology(經濟昆蟲學 雜志）78:290-293 ;W及美國專利號5, 743, 477,將它們全部通過引用W其全文結合在此。
[0024] 編碼本發明的蛋白質的生物活性部分的編碼殺有害生物蛋白的核巧酸序列片段 將編碼至少約 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450 個連續氨基 酸，或達到在本發明的全長殺有害生物蛋白中存在的氨基酸的總數目。在一些實施例中，該 片段是蛋白酶切片段。例如，蛋白酶切片段可W相對于SEQIDN0:3具有至少約100個氨 基酸、約120個、約130個、約140個、約150個、或約160個氨基酸的N末端或C末端截短。 在一些實施例中，在此所涵蓋的運些片段是由例如通過蛋白酶解或通過在編碼序列中插入 終止密碼子來除去C末端結晶結構域而產生。 陽0巧]本發明的優選殺有害生物蛋白由與SEQIDNO: 1-2的核巧酸序列足夠一致的核巧 酸序列編碼，或者運些殺有害生物蛋白與SEQIDN0:3中所列的氨基酸序列足夠一致。"足 夠一致"是指使用標準參數，使用在此描述的比對程序之一，與參比序列相比，具有至少約 60%或65%序列一致性，約70%或75%序列一致性，約80%或85%序列一致性，約90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的氨基酸或核巧酸 序列。本領域的普通技術人員將會認識到，可W對運些數值進行適當地調整W便通過考慮 密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位、等等來確定由兩個核巧酸序列編碼的蛋白質的 相應一致性。
[00%] 為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的一致性百分比，針對最佳比較目的而比對 運些序列。運兩個序列之間的一致性百分比是由運些序列共有的相同位置的數目的函數 (即，一致性百分比二相同位置的數目/位置（例如，重疊位置）的總數目X100)。在一個 實施例中，運兩個序列是相同長度的。在另一個實施例中，該一致性百分比是貫穿該參比序 列的整體來計算的（即，在此所披露的如SEQIDNO: 1-3中任一項的序列）。在兩個序列 之間的一致性百分比可W使用與W下說明的那些相似的技術來確定，其中允許或不允許空 位。在計算一致性百分比中，對典型地準確的匹配進行計數。空位（即，在其中殘基存在于 一個序列中但不存在于另一個序列中的比對中的位置）被認為是具有非一致性殘基的位 置。
[0027] 兩個序列之間的一致性百分比的確定可W通過使用數學算法來完成。用于比較兩 個序列的數學算法的非限制性實例是Karlin(卡林）和Altschul(阿特休爾）（1990)Proc. 化tl.Acad.SciUSA(美國