錄和/或翻譯。表達載體可W是質粒、病 毒或核酸片段、或其它合適媒介的一部分。典型地，表達載體包括與啟動子操作性連接的待 轉錄的核酸。
[0050] "誘導型啟動子"是在響應特定刺激物時介導操作性連接的基因轉錄的啟動子。
[0051] "操作性連接"是兩個核酸序列例如控制序列（典型地，啟動子）和所連接的序列 (典型地，編碼蛋白的序列，也稱為編碼序列）之間的功能性連接。如果啟動子可介導外源 基因轉錄的話，則該啟動子與該外源基因操作性連接。
[0052] "裂解物"是含有已裂解的細胞的內容物的溶液。
[005引"裂解化ysis)"是生物體的質膜和任選細胞壁的破裂，其足W釋放至少一些胞內 內容物，通常通過機械、病毒或滲透機制破壞其完整性而達到。
[0054]"裂解化ysing)"是破壞生物體或細胞的細胞膜和任選細胞壁，其足W釋放至少一 些胞內內容物。
[00巧]"滲透休克"是在突然降低滲透壓后溶液中的細胞破裂。有時誘導滲透休克W將所 述細胞的細胞組分釋放到溶液中。
[0056]術語"質粒"、"載體"和"盒"是指額外的染色體組件，其通常攜帶并非細胞重要 代謝的部分的基因，并且通常呈環狀雙鏈DNA分子的形式。運類組件可W是來自任何來源 的自主復制序列、基因組整合序列、隧菌體或核巧酸序列、線狀或環狀的單鏈或雙鏈DNA或 RNA，其中許多核巧酸序列已經連接或重組到獨特構建體中，所述構建體能夠將啟動子片段 和所選基因產物的DNA序列W及合適的3'非翻譯序列引入細胞中。"轉化盒"是指含有外源 基因并具有除外源基因外的組件的特定載體，所述組件促進特定宿主細胞轉化。"表達盒" 是指含有外源基因并具有除外源基因外的組件的特定載體，所述組件允許增加該基因在外 來宿主中的表達。
[0057]"啟動子"是指導核酸轉錄的核酸控制序列。如本文使用的，啟動子包括臨近轉錄 起始位點的必要的核酸序列。啟動子也任選地包括遠端增強子或阻遏組件，其可距離轉錄 起始位點多達數千個堿基對。
[0058]"重組體"是已經因引入外源核酸或改變天然核酸而被修飾的細胞、核酸、蛋白或 載體。因此，例如，重組細胞可表達在細胞的天然（非重組）形式內不存在的基因或者表達 不同于非重組細胞表達的那些基因的天然基因。重組細胞可W包括但不限于重組核酸，其 編碼基因產物或抑制組件例如突變、剔除、反義、干擾RNA(RNAi)或dsRNA，所述抑制組件降 低細胞中的活性基因產物的水平。"重組核酸"是通常通過核酸的操縱（例如使用聚合酶、 連接酶、核酸外切酶和核酸內切酶）初始在體外形成的核酸，或另外呈在自然界并非正常 存在的形式。可W產生重組核酸，例如將兩個或更多個核酸操作性連接起來。因此，用于本 發明的目的，分離的核酸或通過連接在自然界并非正常連接的DNA分子而體外形成的表達 載體，都被認為是重組體。一旦制備重組核酸并將其引入宿主細胞或生物體，它就可W使用 宿主細胞的體內細胞機制來復制；然而，運樣的核酸，一旦經重組產生，盡管隨后在胞內復 審IJ，但用于本發明的目的，仍然被認為是重組體。同樣，"重組蛋白"是使用重組技術、即通過 重組核酸表達而制備的蛋白。
[0059]"超聲處理"是通過使用聲波能量破壞生物材料例如細胞的過程。
[0060]"轉化"是指將核酸片段轉入宿主生物體或宿主生物體的基因組，導致遺傳上穩定 的遺傳。含有已轉化的核酸片段的宿主生物體稱為"重組的"、"轉基因的"或"轉化的"生 物體。因此，可將本發明的分離的多核巧酸并入重組構建體、典型地DNA構建體，其能夠引 入宿主細胞中并在其中復制。運樣的構建體可W是包括復制系統和能夠在指定宿主細胞中 轉錄和翻譯多膚編碼序列的序列的載體。典型地，表達載體包括例如，處于5'和3'調節序 列的轉錄控制之下的一個或多個已克隆的基因W及選擇標記。運樣的載體也可含有啟動子 調節區（例如，控制誘導型或組成型的、環境或發育調節的或位置特異性表達的調節區）、 轉錄起始位點、核糖體結合位點、轉錄終止位點和/或聚腺巧酸化信號。
[0061]微牛物工括巧造 A.概沐 在本發明的某些實施方案中，微生物經遺傳修飾W改良或提供在各種原料材料上從頭 生長的特性。
[0062] 可將基因和基因產物引入微生物宿主細胞。用于表達基因和核酸分子的合適的 宿主細胞是運樣的微生物宿主：其可W在真菌或細菌家族內廣泛存在并且其在寬泛的溫 度、抑值和溶劑耐受性的范圍內生長。合適的宿主菌株的實例包括但不限于：真菌或酵 母物種，例如曲霉（心_/〇6'知心心)、木霉（7>icAoofe/7ffi3)、酵母畢赤酵母 (巧cAia)、假絲酵母（仍/7扣(劫、漢遜酵母（偏ftseni/知)、克魯維酵母;或 細菌物種，例如變形桿菌（proteobacteria)和放線菌（actinomycetes)W及W下特定屬 的成員：不動桿菌妃Γ)、節桿菌妃Γ)、短桿菌（《reKiAac妃ri"曲)、 食酸菌Uciobrarax)、芽抱桿菌（《acinus)、梭狀芽胞桿菌（C/o別rii/ia)、鏈霉 菌（沉巧〇扣巧rces)、埃希氏菌（仿cAericAia)、沙口氏菌（5?扣oneiia)、假單胞菌 {Pseudomonas)|Mf{Cornyebacterium)〇
[0063] 大腸桿菌很適合用作本發明發酵過程的宿主微生物。
[0064] 含有指導外來蛋白高水平表達的調節序列的微生物表達系統和表達載體是本領 域技術人員眾所周知的。任何運些都可用于構建嵌合基因W產生本發明序列的任一基因產 物。然后可經由轉化技術將運些嵌合基因引入合適微生物中W提供酶的高水平表達。
[0065]例如，可將編碼酶的基因克隆入合適的質粒，并且可將上述起始親代菌株作為宿 主，用所得質粒來轉化。該方法可增加編碼酶的各基因的拷貝數，并且作為結果，可增加運 些酶的活性。對質粒并無特別限制，只要它在微生物中可自主復制。
[0066] 用于轉化合適宿主細胞的載體或盒是本領域眾所周知的。典型地，載體或盒含有 指導相關基因轉錄和翻譯的序列、選擇標記和允許自主復制和染色體整合的序列。合適的 載體包含攜帶轉錄起始控制的基因5'區和控制轉錄終止的DNA片段的3'區。最優選的是 運兩個控制區衍生自與所轉化的宿主細胞同源的基因，盡管應當知道，運樣的控制區不必 衍生自選作生產宿主的具體物種的天然基因。
[0067] 可通過克隆技術，使用分離自天然來源的片段，產生載體的啟動子、cDNA和 3'UTR、W及其它組件（參見例如，MolecularCloning:AL油oratoryManual,Sambrook 等人（第3版，2001，ColdSpringHarborPress;和美國專利號4,683,202 (通過引用 結合））。或者，可使用已知方法經合成產生組件（參見例如，Gene. 1995Oct. 16:164(1): 49-53)。
[0068] B.同源電紀 同源重組是互補DNA序列與同源區比對和交換的能力。將含有與所祀向的基因組序列 ("模板"）同源的序列的轉基因DNA("供體"）引入生物體中，然后在相應的基因組同源序 列的位點上經過重組到基因組中。
[0069] 在宿主生物體中攜帶同源重組的能力具有許多實用的啟示，其可W分子遺傳水平 攜帶并用于產生油質微生物，所述微生物可產生定制的油。通過其特有的性質，同源重組是 精確基因祀向事件，因此，用相同祀向序列產生的大部分轉基因系將會在表型上基本相同， 需要篩選少得多的轉化事件。同源重組也祀向基因插入宿主染色體的事件，可能導致優良 遺傳穩定性，甚至是在缺乏遺傳選擇時。因為不同的染色體位點很可能影響基因表達，甚至 來自異源啟動子/UTR，同源重組可W是在不熟悉的基因組環境中查詢位點并評價運些環境 對基因表達的影響的方法。
[0070] 使用同源重組的一種特別有用的基因工程改造方法是補選特異性宿主調節元件 例如啟動子/UTR，W高度特異性的方式驅動異源基因表達。
[0071] 因為同源重組是精確基因祀向事件，它可用于精確修飾目標基因或區域內的任何 核巧酸，只要已鑒定足夠的側翼區。因此，同源重組可W用作修飾影響RNA和/或蛋白的基 因表達的調節序列的工具。它也可用于修飾蛋白編碼區，試圖修飾酶活性，例如底物特異 性、親和性和Km，并因此影響宿主細胞代謝的所需變化。同源重組提供了操縱宿主基因組的 有力的工具，導致基因祀向、基因轉化、基因缺失、基因復制、基因倒位和交換基因表達調節 元件例如啟動子、增強子和3'UTR。
[0072] 可通過使用含有內源序列片段的祀向構建體祀向"內源宿主細胞基因組內的 目標基因或區域而實現同源重組。運樣的祀向序列可W位于目標基因或區域的5'、目標基 因/區域的3'，或甚至側接目標基因/區域。可將運樣的祀向構建體轉化入宿主細胞，作為 具有額外載體主鏈的超螺旋的質粒DNA、無載體主鏈的PCR產物、或作為線性化的分子。在 一些情況下，有利的是首先將轉基因DNA(供體DNA)中的同源序列暴露給限制酶。該步驟 可W提高重組效率并降低不想要的事件的出現。提高重組效率的其它方法包括使用PCRW 產生含有與所祀向的基因組序列同源的線性末端的轉化的轉基因DNA。
[0073] C.裁體巧裁體紀件 可W通過本領域技術人員已知的技術，考慮到本公開內容，制備用于本發明的微生物 轉化的載體。載體典型地含有一個或多個基因，其中每個基因編碼所需產物（基因產物） 的表達并且與一個或多個控制序列操作性連接，所述控制序列調芐基因表達或使基因產物 祀向重組細胞中的特定位置。
[0074] 本部分分為多個小節。小節1描述了通常在載體上含有的控制序列W及本發明提 供的新的控制序列。小節2描述了通常在載體上含有的基因W及新的密碼子優化方法和使 用本發明提供的那些而制備的基因。
[00巧]1.控制序列 控制序列是調節編碼序列表達或指導基因產物到細胞內或外的特定位置的核酸。調節 表達的控制序列包括例如，調節編碼序列轉錄的啟動子和終止編碼序列轉錄的終止子。另 一控制序列是位于編碼序列末端的3'非翻譯序列，其編碼聚腺巧酸化信號。指導基因產物 到特定位置的控制序列包括編碼信號膚的那些，其指導它所連接的蛋白到達細胞內或外的 特定位置。
[0076] 因此，用于在微生物中表達外源基因的示例性的載體設計含有與在微藻類中具有 活性的啟動子操作性連接的所需基因產物（例如選擇標記或酶）的編碼序列。或者，如果 載體不含有與目標編碼序列操作性連接的啟動子，則可將編碼序列轉化入細胞，使得它與 內源啟動子在載體整合點上操作性連接。
[0077] 用于表達外源基因的啟動子可W是與該基因天然連接的啟動子或可W是異源啟 動子。
[0078] 啟動子通常可被表征為組成型或誘導型。組成型啟動子通常是具有活性或功能W 在所有時間（或在細胞生命周期中的某些時間）W相同水平驅動表達。相反，誘導型啟動 子僅在響應刺激物時才有活性（或失活）或被顯著上調或下調。運兩類啟動子在本發明方 法中都找到應用。用于本發明的誘導型啟動子包括在響應刺激物時介導操作性連接的基因 轉錄的那些，所述刺激物例如外源提供的小分子、溫度（熱或冷）、培養基中缺氮等。合適的 啟動子可W激活基本沉默的基因的轉錄或上調（優選大幅度地）W低水平轉錄的操作性連 接的基因的轉錄。
[0079] 包含終止區控制序列是任選的，并且如果用的話，則選擇首先是方便的一個，因為 終止區是相對可互換的。終止區對于轉錄起始區（啟動子）而言可W是天然的，對于目標 DNA序列可W是天然的，或者可W得自其它來源。參見例如，化en和化OZCO,NucleicAcids Res. (1988) 16:8411。
[0080] 2.基因和密碼子優化 典型地，基因包括啟動子、編碼序列和終止控制序列。當通過重組DNA技術裝配時，基 因可W被稱為表達盒并且可W側接限制位點，W便插入載體，所述載體用于將重組基因引 入宿主細胞。表達盒可W側接來自基因組或其它核酸祀的DNA序列，W促進表達盒通過同 源重組而穩定整合到基因組中。或者，載體及其表達盒可W不整合（例如，附加體），在運種 情況下，載體典型地包括復制起點，其能夠為異源載體DNA的復制做準備。
[0081] 載體上存在的常見基因是編碼蛋白的基因，其表達允許將含有該蛋白的重組細胞 與不表達該蛋白的細胞區分開來。運樣的基因，及其相應的基因產物，稱為選擇性標記或選 擇標記。多種多樣的選擇標記的任一種都可用于轉基因構建體，用于轉化本發明的生物體。
[0082] 對于重組蛋白的優化表達，有益的是使用運樣的編碼序列，其產生具有所轉化的 宿主細胞最佳使用的密碼子的mRNA。因此，轉基因的適當表達可需要轉基因的密碼子使用 與轉基因在其中表達的生物體的特定密碼子偏倚是匹配的。該效應的基礎精確機制有許 多，但包括當該需要滿足時，適當平衡可用的氨酷化tRNA池與細胞中所合成的蛋白質，同 時更有效翻譯轉基因信使RNA(mRNA)。當轉基因中的密碼子使用未被優化時，可用的tRNA 池不足W允許異源mRNA的有效翻譯，導致核糖體停頓和終止并可能導致轉基因mRNA的不 穩定性。
[0083] D.兩個或審《個外源基閑的表武 此外，經基因工程改造的微生物可包含和表達不止一個外源基因。使用誘導型啟動子， 可表達一個或多個基因，所述啟動子允許運些受控基因按照相對時間來表達。兩個或更多 個外源基因的表達可W是處于同一誘導型啟動子控制之下或處于不同誘導型啟動子的控 制之下。在后一種情況下，可在第一時期誘導第一個外源基因的表達（其間第二個外源基 因的表達可W或可W不被誘導），而可在第二時期誘導第二或更多個外源基因的表達（其 間第一個外源基因的表達可