經工程改造以利用非常規氮源的微生物的制作方法
【專利說明】經工程改造w利用非常規氮源的微生物
[OOCM] 相關申請 本申請要求于2013年1月4日提交的美國臨時專利申請順序號61/748, 901和于2013 年3月14日提交的61/782, 351的優先權權益；運兩者的內容通過引用結合到本文中。 [000引背景 在發酵工業，細胞培養基通常被配制為提供宿主細胞系生長所需的所有營養素，特別 強調的是滿足細胞系對碳、氮、憐、硫和其它主要營養素的需要。一些細胞系需要額外成分， 包括氨基酸、痕量礦物質和金屬、W及復雜的生長因子。運些營養素的存在為所選擇的生物 體W及（遺憾的是）為任何可能污染的生物體，提供合適的生長環境。在該環境中，需要生 產生物體與細胞培養物中的任何污染生物體直接競爭。
[0003] 甚至在健壯的宿主中，培養物的機會性感染與由產品生產的需要所導致的代謝負 擔的組合是單一培養操作中的主要問題。通常認為工業的穩健性是對宿主菌株具有特異性 并因此在發展過程的晚期難W可預見性地經工程改造到生物體中的多基因性狀。選擇性的 生長抑制劑例如細菌抗生素的添加，對于對生長抑制劑具有抗性的宿主生物體來說是用于 產生更穩健的發酵環境的一種方法。然而，抗生素的添加通常是不可取的或難W實施的，并 且自發抗性污染頻繁產生。
[0004] 因此，需要經合理地工程改造的性狀，當經工程改造到宿主生物體時，其產生穩健 的單一培養發酵環境。
[000引發明概述 在某些實施方案中，本發明設及經基因工程改造的生物體，其中所述經基因工程改造 的生物體已被包含任一種或多種本文公開的序列的核酸分子轉化。
[0006] 在某些實施方案中，本發明設及經基因工程改造的生物體，其中所述經基因工程 改造的生物體已被核酸分子轉化；所述核酸分子包含非天然基因；和所述非天然基因編碼 選自W下的非天然酶：脈基甲酸水解酶、雙縮脈酷胺水解酶、Ξ聚氯酸酷胺水解酶、鳥嚷嶺 脫氨酶、Ξ聚氯胺脫氨酶、異丙基Ξ聚氯酸一酷胺異丙基氨基水解酶、氨臘水合酶、脈酶和 脈簇化酶。
[0007] 在某些實施方案中，本發明設及方法，包括W下步驟： 使任一種上述經基因工程改造的生物體接觸底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含約10%重量至約100%重量的量的式Ι-ΙΠ的任一個的含氮化合物 或其鹽； 與所述經基因工程改造的生物體相同物種的天然生物體不能代謝（即，用作氮源）所 述含氮化合物； 所述經基因工程改造的生物體將底物轉化為產物；和 式I化合物是
其中，每次出現時獨立地，
遙5-、6-、9-或10-元芳基或雜芳基； R是-OH、-%H、-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基訊η是 0、1、2、3、4 或 5 ; 式II化合物是
II 其中，每次出現時獨立地， X是-畑-、-Ν(烷基）-、-〇-、-C腳)廠、-S-或不存在； Υ是-Η、-畑2、-Ν(Η)(烷基）、-Ν(烷基）2、-COzH、-CN或取代的或未取代的烷基；和Ri是-H、-OH、-C02山-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基訊 式III化合物是
III 其中，每次出現時獨立地， Y是-H、-畑2、-N(H)(烷基）、-N(烷基）2、-C02H、-CN或取代的或未取代的烷基。
[0008] 在某些實施方案中，本發明設及方法，包括W下步驟： 使任一種上述經基因工程改造的生物體接觸底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含約10%重量至約100%重量的量的選自W下的含氮化合物：Ξ嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨臘、2-氯基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、雙縮脈、二 亞乙基Ξ胺、Ξ亞乙基四胺、1,3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基贓嗦、贓嗦和 脈基甲酸（alio地ante);和 所述經基因工程改造的生物體將底物轉化為產物。
[0009] 在某些實施方案中，本發明設及方法，包括W下步驟： 使任一種上述經基因工程改造的生物體接觸底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分基本上由選自W下的含氮化合物組成嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨臘、2-氯 基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、雙縮脈、二亞乙基Ξ胺、Ξ亞乙基 四胺、1，3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基贓嗦、贓嗦和脈基甲酸；和 所述經基因工程改造的生物體將底物轉化為產物。
[0010] 在某些實施方案中，本發明設及方法，包括W下步驟： 使任一種上述經基因工程改造的生物體接觸底物， 其中 所述底物由含氮部分和不含氮部分組成； 所述含氮部分由選自W下的含氮化合物組成嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨臘、2-氯基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、雙縮脈、二亞乙基Ξ胺、Ξ亞乙基四胺、 1，3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基贓嗦、贓嗦和脈基甲酸；和 所述經基因工程改造的生物體將底物轉化為產物。
[0011] 在某些實施方案中，本發明設及通過任一種上述方法制備的產物。
[0012] 在某些實施方案中，本發明設及包含與啟動子操作性連接的基因的重組載體，其 中所述基因編碼酶；和所述酶是脈基甲酸水解酶、雙縮脈酷胺水解酶、Ξ聚氯酸酷胺水解 酶、鳥嚷嶺脫氨酶、Ξ聚氯胺脫氨酶、異丙基Ξ聚氯酸一酷胺異丙基氨基水解酶、氨臘水合 酶、脈酶或脈簇化酶。
[0013] 附圖簡述 圖1描繪了Ξ聚氯胺降解途徑的示意圖。1 -Ξ聚氯胺脫氨酶（tzrA)(EC3. 5. 4.-); 2 -Ξ聚氯酸二酷胺脫氨酶（鳥嚷嶺脫氨酶）巧C3. 5.4.3) ;3 -N-異丙基Ξ聚氯酸 一酷胺異丙基氨基（Ξ聚氯酸一酷胺）水解酶巧C3. 5. 99. 4) ;4 -Ξ聚氯酸水解酶巧C 3. 5. 2.15) ;4a-簇基雙縮脈脫簇酶，自發反應；5 -雙縮脈酷胺水解酶巧C3. 5. 1.84); 6 -脈基甲酸水解酶巧C3. 5. 1.54)。氮可W通過作用于Ξ聚氯胺的完整途徑的作用被同 化（作為畑3)，釋放6molNVmol^聚氯胺，或經由作用于途徑的中間體的酶的亞類（例 如，作用于Ξ聚氯酸的步驟4、4a、5和6,釋放3molNHs/molS聚氯酸）。
[0014] 圖2列表顯示能夠遞送可被工程化生物體利用的氮的示例性化合物。
[001引圖3列表顯不編碼二聚氛胺降解途徑的DNA和蛋白序列。
[0016] 圖4描繪了氨臘同化途徑的示意圖。氨臘水合酶巧C4. 2. 1. 69)將氨臘轉化為 脈后，可經由脈酶巧C3. 5. 1.5)或通過脈簇化酶巧C6. 3. 4.6)和脈基甲酸水解酶巧C 3. 5. 1. 54)將脈降解。
[0017] 圖5-10描繪了本發明的多種質粒。
[0018] 圖11列表顯示用于實施例9的MOPS培養基中的成分濃度。
[0019] 圖12描繪了在含有不同濃度的錠離子或Ξ聚氯胺的培養基中的NS88和NS91 (對 照）的生長進程。
[0020] 圖13描繪了在含有不同濃度的錠離子或雙縮脈的培養基中的NS90和NS91 (對 照）的生長進程。
[0021]圖14描繪了在具有不同氮源的MOPS培養基中生長的培養物在48h后拍攝的圖 像。從左到右：NS88,用10mMS聚氯胺；NS91，用10mMS聚氯胺；NS90,用10ml雙縮脈 (重復1) ;NS90,用10ml雙縮脈（重復。；和NS91，用10ml雙縮脈。
[0022] 圖15描繪了本發明的質粒。
[0023] 圖16描繪了本發明的質粒。
[0024] 圖17描繪了在含有無氮源、脈或氨臘的培養基中的NS100 (對照）和NS101的生 長進程。
[00幼圖18描繪了在含脈培養基中的NS100 (對照）和NS101的群體分數。
[0026] 圖19描繪了在含氨臘培養基中的NS100 (對照）和NS101的群體分數。
[0027]圖20描繪了在不含氮源的培養基、或含氨臘的培養基中的NS100 (對照）和 NS101的生長進程。
[0028]圖21描繪了在不同含氮培養基上，在抗生素存在下，本發明生物體的生長（對于 SC氨基酸培養基的組成，參見圖33)。
[0029] 圖22列表顯示本發明的4種生物體在不同培養基上生長后，在600nm處的光密 度。
[0030] 圖23列表顯示本發明的3種生物體在不同培養基上生長后，在600nm處的光密 度。
[003。圖24描繪了相比天然生物體在畑斜上的標準曲線，本發明的4種生物體（NS91 =對照）在0.25mlΞ聚氯胺上的生長。因為Ξ聚氯胺具有6個氮原子，有能力利用Ξ聚 氯胺的生物體的效率應當高約6倍（參見例如，與在1.5mlNH4CI上的天然生物體相比， 在0. 25mlΞ聚氯胺上的NS110)。
[003引圖25描繪了相比天然生物體在畑典1上的標準曲線，本發明的4種生物體（NS91=對照）在0.25 ml Ξ聚氯酸二酷胺上的生長。因為Ξ聚氯酸二酷胺具有5個氮原子，有能 力利用Ξ聚氯胺的生物體的效率應當高約5倍（參見例如，與在1. 25 ml NH4CI上的天然 生物體相比，在0. 25 ml Ξ聚氯酸二酷胺上的NS110)。
[003引 圖26描繪了本發明的不同生物體在0. 5 ml NH4CI上的生長。重要的是，圖26-28 中描述的生物體例如NS120、NS91、NS107和NS123是衍生自大腸桿菌化coii) K12、大腸 桿菌B、大腸桿菌化ooks和大腸桿菌MG1655的大腸桿菌菌株和意圖顯示本發明跨越大腸桿 菌不同菌株的寬度。
[0034]圖27描繪了本發明的不同生物體在不含氮的培養基上的生長。
[0035] 圖28描繪了本發明的不同生物體在含有0.5mMS聚氯胺的培養基上的生長。
[0036] 圖29列表顯示本發明的不同質粒的概述。
[0037] 圖30列表顯示本發明的不同生物體的概述。
[0038] 圖31列表顯示MOPS限定培養基中的成分和各成分的摩爾濃度，其用于例如大腸 桿菌。
[0039] 圖32列表顯示YNB培養基中的成分和各成分的重量濃度，其用于例如釀酒酵母 (S.cerevisiaS)。
[0040] 圖33列表顯示SC氨基酸培養基中的成分和各成分的重量濃度。
[00川發明詳述 概沐 在某些實施方案中，本發明設及經基因工程改造的宿主生物體，其中所述經基因工程 改造的宿主生物體具有從復雜底物獲得生長限制性營養素的非天然能力；而天然宿主生物 體不能代謝該復雜底物或將其用作營養素。在某些實施方案中，所述非天然能力將為生物 體提供明顯的競爭優勢，并且對發酵中污染物的成功提供主要障礙。在某些實施方案中，所 述經基因工程改造的宿主生物體是細菌、酵母、真菌、哺乳動物細胞或昆蟲細胞。在某些實 施方案中，所述經基因工程改造的宿主生物體是細菌或酵母。
[0042] 在某些實施方案中，本發明設及使用上述經基因工程改造的宿主生物體的方法， 包括使所述經基因工程改造的宿主生物體接觸經改良的細胞培養基。在某些實施方案中， 本發明設及使用上述經基因工程改造的宿主生物體的方法，包括使所述經基因工程改造的 宿主生物體接觸經改良的細胞培養基，其中所述經基因工程改造的宿主生物體將細胞培養 基轉化為產物。在某些實施方案中，使用該方法提供獨特和祀向方式W促進所需經基因工 程改造的宿主生物體的生長。在某些實施方案中，上述方法使污染生物體的生長減到最小， 提供有價值的競爭優勢，并允許控制一系列有價值產物的生產。
[0043]在某些實施方案中，本發明的方法減少或消除了對在大規模酵母培養中使用預防 性的抗生素的需要。因新出現的環境考慮和社會壓力所致，避免不必要的抗生素具有重要 的利益。另外，在某些實施方案中，所述技術可W應用于細菌系統，其中可W不添加抗生素。
[0044] 在某些實施方案中，所述經基因工程改造的宿主生物體是酵母；和所述產物是乙 醇、異下醇、乳酸、異戊二締類、脂質和酶產物、或高價值的專業化學品。
[0045] 在某些實施方案中，所述經基因工程改造的宿主生物體是細菌；和所述產物是下 醇、乙醇、異丙醇、1，3-丙二醇（PD0)、1，4-下二醇度DO)、班巧酸、衣康酸、酶產物、多元醇、 蛋白質產物或高價值的專業化學品。
[0046] 在某些實施方案中，本發明的技術可用于產生一種或多種日用品、精細化學品和 藥品。
[0047] 定父 "干重"和"干細胞重"是指相對缺水時所測的重量。例如，對于油質的細胞，當包含指 定百分率的特定成分的干重時，是指該百分率是根據已基本除去所有水后的細胞重量而計 算。
[004引"外源基因"是已引入細胞中（例如通過轉化/轉染）的編碼RNA和/或蛋白表達 的核酸，并且也稱為"轉基因"。包含外源基因的細胞可W稱為重組細胞，其中可引入另外的 外源基因。相對于所轉化的細胞而言，外源基因可W來自不同物種（并因此是異源的），或 來自相同物種（并因此是同源的）。因此，外源基因可包括同源基因，相對于基因的內源拷 貝而言，其占據細胞基因組的不同位置或處于不同控制之下。外源基因在細胞中可存在著 不止一個拷貝。外源基因可W作為基因組（核或質體）的插入物或作為附加體分子而維持 在細胞中。
[0049] "表達載體"或"表達構建體"或"質粒"或"重組DNA構建體"是將核酸引入宿主 細胞的媒介。核酸可W是經由人類干預（包括重組方式或直接化學合成）而產生的核酸， 具有一系列指定的核酸組件，其允許特定的核酸轉