脂糖凝膠進行電泳檢測，結果(圖1)說明提取到的基因組DNA質量符合要求。
[0014]實施例2:海藻酸裂解酶癌因的擴增與ΤΑ克隆
海藻酸裂解酶癌因的擴增及克隆如圖2所示，首先從全基因組測序結果中查找的全長基因序列，并設計一對特異性引物，序列如下:
SHA-4-F:GGATCCATGAAAAGCGCAATCAACTATCTCASHA-4-R:GCGGCCGCTTATTGATTAACATGTGTCAAATTTTCG
5’端引物有GGATCC特征序列，并由此形成BamH I酶切位點；3’端加GCGGCC特征序列，形成Not I酶切位點。
[0015]在PCR 反應混合液中加入 10ng 的 Marinicatena algina tilytica SH-52 基因組DNA作為模板，同時加入50ng的特異性引物SHA-4-F和SHA-4-R，2.5 μ 1 dNTP (10mM)，2.5μ1的Pfu反應Buffer和0.5 μ 1的pfu (5U/ul)聚合酶(北京全式金生物技術有限公司)，加入雙蒸水使終體積為25 μ 1。在PCR儀上于94°C加熱3min，然后按照94°C、30s，57°C、30s，72°C、lmin的程序進行25個循環的反應，最后在72°C延長反應lOmin的程序進行PCR反應擴增得到癌因，反應完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物。回收并純化全長基因DNA (2.3Kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒亞克隆到PMD19-T (大連寶生物公司)載體上，實驗操作按試劑盒的說明書進行，反應過夜后用反應混合液轉化大腸桿菌感受態Transl-Tl (北京全式金生物技術有限公司)，采用堿裂解法提取質粒DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小(圖3)，選取大小和理論值相符的重組質粒進行酶切檢測。連接成功的重組質粒PMD19T-S?-嶺.一條大小為4.9kb左右的5??-癌因DNA片段。進一步用BamH I和Not I雙酶切，結果產生兩條片段，一條大小為2.6kb左右，另一條為2.3kb左右(圖4、5)。測序分析證明重組質粒載體中插入的全長基因序列正確。再次確認是連接成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌Transl-Tl，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒PMD19T-S?-么
[0016]實施例3:原核表達載體PGEX-4T-1-兄K的構建
PGEX-4T-1-兄K的構建策略如圖6所示，用BamH I (TaKaRa)和Not I (TaKaRa)切開純化的原核表達載體PGEX-4T-1 (購自GE Healthcare公司)和pMD19T-S?-么通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收PGEX-4T-1被切割后產生的載體片段pGEX-4T-l (4.9kb)及pMD19T-S?-4皮切割產生的癌因的DNA片段(2.3kb左右)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pGEX_4T_l載體片段和癌因的DNA片段產生原核表達載體PGEX-4T-1-S?-么用連接反應混合物轉化高效率的大腸桿菌感受態細胞Transl-Tl (北京全式金生物技術有限公司)，把轉化后的大腸桿菌涂于加有氨節青霉素(Amp，100mg/L)的平板上，于37°C過夜培養，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質粒(圖7)，用BamH 1、Not I (TaKaRa)進行雙酶切檢測，連接成功的質粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產生4.9kb和2.3kb左右大小的兩條帶(因為BamH I，Not I在載體處都只有單一識別位點，故雙酶切質粒應有兩個片段)(圖8)。將連接成功的質粒載體pGEX-4T-l-S?-4重新轉化大腸桿菌Transl-Tl，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒 pGEX-4T-l-S?-么
[0017]實施例4:海藻酸裂解酶SHA-4蛋白的表達與表達條件的優化
用原核表達載體pGEX-4T-l-S?-|化大腸桿菌BL21的感受態細胞(天根生化科技)。挑取單菌落加入5mL LB (含有Amp 100mg/L)中，37°C過夜培養(0D6。。約為1.5)。然后轉接到100ml LB (含有Amp 100mg/L)中，當0D_達到0.6-0.8時，分別加入IPTG于不同條件下誘導，離心收集菌體，加入5XSDS-PAGE上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于100°C加熱lOmin煮沸菌體。冰浴冷卻后于4°C離心(12000rpm)10min，取上清進行SDS-PAGE。根據文獻資料和軟件分析預測目的融合蛋白大小為102kDa左右(GST融合標簽為26kDa)，采用12%分離膠。SDS-PAGE電泳參看《分子克隆實驗指南(第三版)》。SDS-PAGE電泳結果(圖
9、10、11)表示在28°C下經終濃度為0.1mM IPTG誘導6h后SHA-4蛋白表達量最高。
[0018]實施例5:海藻酸裂解酶SHA-4蛋白的純化，具體步驟如下:
(1)菌體破碎:將在28°C、0.1mM IPTG下大量誘導表達6h后的1L菌體，經超聲破碎菌體(工作5s，休息5s) 30min ；
(2)收集上清和沉淀:將菌體破碎液于4°C、12000rpm離心15min，分別保留上清和沉淀；
(3)蛋白破碎上清液用0.22um濾器進行過濾，除去雜質；
(4)GSTSefinose Resin柱預處理:將保存柱子的20%的乙醇放出；10倍柱床體積的 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HP04，1.4mM KH2P04，137mM NaCl, 2.7mM KC1)平衡柱子，流速為
0.5-lml/min ；
(5)蛋白樣品上柱:流速為0.5ml/min，收集流出液；
(6)洗柱:使用5-10 倍體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HP04,1.4mM KH2P04，137mM NaCl,
2.7mM KC1，PH7.4)洗滌；
(7)洗脫:使用5倍柱體積洗脫緩沖液(lOmMGlutath1ne (還原型)，50mM Tris-HCl,PH8.0)洗脫，重復2-3次，收集洗脫液；
(8)GSTSefinose Resin 柱的后處理:3_5 倍柱體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HP04,1.4mMKH2P04，137mM NaCl, 2.7mM KC1，PH7.4) ;3_5倍柱體積去離子水洗柱；于4°C，2_3倍柱體積的20%乙醇中保存；
(9)SDS-PAGE檢測:分別取20μ 1各洗脫梯度流出液，流川液，洗滌液，粗酶液加入5ul的5X SDS-PAGE上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于100°C加熱10分鐘煮沸，上樣，進行SDS-PAGE分析，純化結果見圖12，最終獲得SHA-4純化蛋白。
[0019]通過上述的實驗，本發明達到了如下的結果:利用本發明的SHA-4的原核表達載體(pGEX-4T-l-S?-4)轉化大腸桿菌(BL21)，可實現SHA-4蛋白的表達，表達的SHA-4有部分在上清中，因此不需要大規模培養細菌，純化SHA-4蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。
[0020]實施例6:海藻酸裂解酶SHA-4蛋白的特性分析，具體內容如下:
1、酶活測定
由于海藻酸裂解酶裂解海藻酸鈉產生的不飽和糖醛酸在235nm處具有吸收值，通過測量反應液在該波長下的變化而計算相應的酶活。
[0021]在反應體系(20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.3%海藻酸鈉)中加入10 μ g的海藻酸裂解酶蛋白啟動反應，lOmin后測量235nm處吸光值的變化。
[0022]酶活定義:在波長235nm下吸光值，以每分鐘吸光值增加1定義為一個酶活單位
(U)0
[0023]通過測定，純化后的重組海藻酸裂解酶SHA-4蛋白的酶活可以達到21U/mg，遠高于純化前的酶活。
[0024]2、酶學性質的研究
(1)海藻酸裂解酶SHA-4蛋白最適催化pH值測定
在pH緩沖體系(pH6.0-8.0磷酸鈉緩沖液或pH8.0-9.0 Tris-HCl緩沖液)中用海藻酸鈉為底物測定海藻酸裂解酶的最適反應PH，溫度為37°C，反應時間為lOmin，將處于最適pH下的酶活力定義為100%，海藻酸裂解酶SHA-4的活性和穩定性與pH值的關系曲線如圖13所示，在強酸性或強堿性條件下酶的活力和穩定性都不高，海藻酸裂解酶SHA-4最適酶反應pH條件為7.5。
[0025](2)海藻酸裂解酶SHA-4蛋白最適催化溫度測定
在PH7.0的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定酶的最適反應溫度，反應時間為lOmin，將處于最適溫度下的酶活力定義為100%，結果如圖14所示，酶的最適反應溫度37°C，在35?50°C范圍內有較高的酶活力；當溫度降到30 V時，酶活迅速下降，只有峰值的29.
[0026](3)金屬離子對海藻酸裂解酶SHA-4蛋白活性的影響
在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定不同金屬化合物(反應液中金屬離子的濃度為0.5mM)對海藻酸裂解酶SHA-4蛋白活性的影響，以添加相同體積水的溶液作為對照組，在最適溫度37°C下測定酶活力，將對照組的酶活力定義為100%，結果如圖15所示，Hg2+對酶活有完全抑制作用，Ca2+，Na+，Co2+與K +對酶活有強烈抑制作用，Mg2+、Ni+，Zn2+與Fe2+對酶活有部分抑制作用，而Cu 2+與Μη 2+對酶活有部分促進作用。
[0027](4)海藻酸裂解酶SHA-4蛋白的底物特異性
將純化后的海藻酸裂解酶SHA-4 (10 μ g)添加到20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，同時添加質量分數為0.3%的不同底物(海藻酸鈉、PloyG、PloyM)，在反應溫度為37°C下反應lOmin，結果如圖16所示，SHA-4對PloyG與PloyM均有底物特異性，但對于PloyM的底物特異性相對略強一些。
[0028]傳統方法一般是通過利用海藻酸鈉分解菌進行發酵，分離、純化得到海藻酸裂解酶，但卻存在野生菌產酶量低，操作繁瑣，生產成本高等問題，成為酶解法大量制備海藻酸低聚糖的瓶頸，限制了海藻酸裂解酶的進一步推廣使用。
[0029]本發明采用基因工程手段，構建含有厭氧菌的海藻酸裂解酶基因的工程菌株，通過誘導表達大量生產海藻酸裂解酶，這與傳統方法相比，不僅使得海藻酸裂解酶的得率大大提高，而且酶的純化過程也簡單易于操作。
【主權項】
1.一種海藻酸裂解酶SHA-4基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2.權利要求1所述海藻酸裂解酶SHA-4基因的原核表達載體，其特征在于:該載體含有Ptac啟動子、終止子、海藻酸裂解酶基因細菌核糖體結合位點RBS、GST標簽，兄癌因的上游為Ptac啟動子，Ptac啟動子的下游為可被IPTG誘導的操縱子序列，緊靠SHA-4基因起始密碼子上游的是一個GST標簽序列。
【專利摘要】本發明公開了一種海藻酸裂解酶SHA-4基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，本發明構建了海藻酸裂解酶SHA-4基因的原核表達載體，該載體能夠在較短時間內獲得表達產物海藻酸裂解酶SHA-4，且具有廣泛的底物特異性，既能利用聚甘露糖醛酸PolyM也能利用聚古羅糖醛酸PolyG為底物，酶活達到21U/mg，是一種具有廣泛應用前景的雙功能酶，本發明原核表達載體和整體表達系統容易操作，便于工業化生產。
【IPC分類】C12N15/60, C12N15/70
【公開號】CN105255923
【申請號】CN201510710045
【發明人】伊日布斯, 何漫漫, 李曙梅, 吳銘杰, 嚴金平
【申請人】昆明理工大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月28日