一種海藻酸裂解酶sha-4基因及其原核表達載體的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種海藻酸裂解酶SHA-4基因及其原核表達載體PGEX-4T-1-S?-么該載體高效表達海藻酸裂解酶蛋白SHA-4。
【背景技術】
[0002]近年來海洋資源的開發利用已逐漸成為研究的熱點，海藻酸因其獨特的理化性質在食品、醫藥和化工等領域具有廣泛的應用前景。海藻酸寡糖因具有多種生理活性，成為開發新藥的聚焦點。同時海藻酸作為最豐富的海洋生物質之一，因具有以下優勢:(1)光合作用效率高，生長快，產量高，資源豐富；(2)生長不占用耕地；(3)幾乎不含有木質素，纖維素的含量很少，預處理簡單，便于微生物的利用和發酵；從而在生物能源領域受到了廣泛的關注。目前，降解海藻酸的方法可分為三大類:第一類是化學降解法，目前廣泛采用的是酸水解法，這種方法操作步驟繁瑣，反應條件劇烈。第二類是物理降解法，例如超聲降解海藻酸。第三類是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸條件溫和，過程可控，得率高，綠色安全，作用機理明確，產物確定，可以根據具體目的產物要求選擇單一的酶制劑或使用不同底物專一性組合的酶制劑。
[0003]海藻酸裂解酶主要由海藻酸分解菌和一些海洋動植物等產生，具有很大的應用前景。但野生型海藻酸分解菌產酶量低且成本高，很難達到實際的應用要求。因此，通過基因工程手段對海藻酸裂解酶基因進行異源表達是提高海藻酸裂解酶產量的最有效途徑。1993年，Boyd等首次克隆了 Pseudomoms akiflorara海藻酸裂解酶的編碼基因algL并在大腸桿菌中進行了表達，其粗酶液活性達到146U/mg。1996年Frederic等將PseudomormsaJgiflorara中編碼海藻酸裂解酶的基因aly在大腸桿菌中表達，其催化活性達到97U/mg。2009 年，GaofeiPseudoalteromonas sp.CY24 中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，并在大腸桿菌中進行表達，得到一個催化活性為121.6U/mg，分子量為58KD的蛋白。2012年，Hwan Hee Park等利用泣化柳遍mss sp.MJ-3的基因組構建基因文庫，篩選得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并將其在大腸桿菌中表達，得到了一種對polyM和polyG都有活性的雙功能酶。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種海藻酸裂解酶SHA-4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本海藻酸裂解酶SHA-4基因來源于ifariflicaiefla alginatilytica SH-52 (保藏編號為CCTCC NO:M2013073，該保藏菌株在本申請申請日之前已經在其他專利申請文件中公開過)，由本實驗室全基因組測序獲得，通過BLAST比對，結果顯示與菌株ZMeWiagalactanivorans DsiJT的海藻酸裂解酶的相似度為64%。
[0005]本發明另一目的是提供一種海藻酸裂解酶SHA-4基因的原核表達載體，該載體含有Ptac啟動子、終止子和海藻酸裂解酶基因細菌核糖體結合位點RBS、GST標簽，兄癌因的上游為Ptac啟動子，Ptac啟動子的下游為可被IPTG誘導的操縱子序列，緊靠兄^-癌因起始密碼子上游的是一個GST標簽序列，可生成融合表達蛋白，之后通過凝血酶可將GST標簽切除而不影響目的蛋白的結構活性。
[0006]本發明的另一個目的是將algina tilytica SH-52海藻酸裂解酶SHA-4基因的原核表達載體應用在制備海藻酸裂解酶SHA-4中。
[0007]為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:
1、teas algina tilytica SH-52海藻酸裂解酶基因5??的獲得和原核表達載體的構建
(1)根據Marinicatenaalgina tilytica SH-52海藻酸裂解酶因編碼框序列和原核表達載體PGEX-4T-1多克隆位點，設計1對特異引物如下:
SHA-4-F:5’ - GGATCCATGAAAAGCGCAATCAACTATCTCA-3’
SHA-4-R: 5 ’ -GCGGCCGCTTATTGATTAACATGTGTCAAATTTTCG-3，，在上下游引物的 5 ’ 端分別加入BamH I和Not I酶切位點(下劃線為酶切位點)；提取ifariflicaiefla algina tilyticaSH-52的基因組，使用上述引物進行擴增；
(2)回收并純化海藻酸裂解酶全長基因片段，并將其連接到PMD19-T載體上，采用SDS-堿裂解法提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD19T-S?-名
(3)構建原核表達載體pGEX-4T-l-S?-么用BamHI和Not I雙酶切pMD19T_S?-存口PGEX-4T-1，并回收純化海藻酸裂解酶癌因片段及pGEX-4T-l載體片段，然后連接、轉化、抽提質粒進行雙酶切驗證，獲得原核表達載體PGEX-4T-1-S?-么進行測序后，將測序結果進行生物信息學分析。
[0008]2、海藻酸裂解酶SHA-4的原核表達
使用熱刺激法將PGEX-4T-1-S?-禱專入大腸桿菌BL21 (DE3)中，通過IPTG誘導篩選最佳表達條件，并在最適條件下進行大量表達；
3、海藻酸裂解酶SHA-4的蛋白純化
收集菌體，進行超聲破碎，得到的上清通過GST瓊脂糖凝膠柱進行純化，收集純化后的蛋白用于SHA-4的蛋白表達檢測及下一階段實驗；
4、重組海藻酸裂解酶SHA-4的特性研究
對純化后的海藻酸裂解酶SHA-4進行以下特性研究:最適溫度，最適pH等，本發明獲得的重組海藻酸裂解酶SHA-4，其最適溫度為37°C，最適pH為7.5 ;本發明中采用的測定方法為常規海藻酸裂解酶酶活性測定方法，測定反應底物在Α235ηηι處吸光值的變化。
[0009]本發明對新型的來自于厭氧海藻酸分解菌algina tilytica SH-52中海藻酸裂解酶基因5^-4?行了擴增，并進一步進行原核表達和蛋白純化，獲得了 SHA-4蛋白。現有技術海藻酸裂解酶的野生菌株通過發酵培養到產酶，至少需要3天的時間，而本發明的基因工程菌株只需6h即可獲得最大量的目的蛋白，本發明所獲得的重組海藻酸裂解酶SHA-4蛋白具有廣泛的底物特異性，除可以利用海藻酸外還可以利用PolyM和PolyG，酶活可以達到21U/mg，是一種具有廣闊應用前景的功能酶，本發明原核表達載體及整體表達系統容易操作，便于工業化生產；本發明解決了現有的產海藻酸裂解酶菌株酶產量較低的問題，也為進一步對海藻酸裂解酶SHA-4進行機理及機制研究奠定了基礎。
【附圖說明】
[0010]圖1是本發明Marinicatena algina tilytica SH-52基因組DNA的檢測不意圖，圖中:Μ是DNA marker ; 1和2是基因組DNA ；
圖2是本發明海藻酸裂解酶SHA-4基因的TA克隆策略示意圖；
圖3是本發明重組質粒pMD19T-S?-4的電泳檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ;1、2是 pMD19T-S?-名
圖4是本發明重組質粒PMD19T-兄K的雙酶切檢測示意圖，圖中:Μ是DNA marker ；1-3是BamH I與Not I雙酶切的pMD19T_S?-順粒；
圖5是本發明重組質粒pMD19 ?-SHA-M PCR檢驗示意圖，圖中:Μ是DNA marker ；1是負對照；2是以pMD19T-兄K為模板，用SHA-4-F，SHA-4-R為引物擴增的PCR產物；
圖6是本發明海藻酸裂解酶癌因的原核表達載體構建示意圖；
圖7是本發明重組質粒pGEX-4T-l-S?-4的電泳檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ；
1、2 是 pGEX-4T-l-S?-名
圖8是本發明重組質粒pGEX-4T-l-S?-4的酶切檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ；
1是BamH I與Not I雙酶切的的pGEX-4T-l-S?-4質粒；
圖9是本發明海藻酸裂解酶SHA-4表達的SDS-PAGE檢測示意圖，圖中:Μ是蛋白marker ；1是pGEX_4T_l質粒在37 °C，未經IPTG誘導后，10h的細菌總蛋白；2是pGEX-4T-l-兄K質粒在37 °C，未經IPTG誘導后，10h的細菌總蛋白；3_8是pGEX-4T-l-S?-4質粒在 37°C，經 ImM IPTG 誘導后，0、2、4、6、8、10h 的細菌總蛋白；
圖10是本發明海藻酸裂解酶SHA-4在37°C下表達情況，圖中:M是蛋白marker ;1是pGEX-4T-l-S?-4質粒在 37°C未經 IPTG 誘導，6h 的細菌總蛋白；2_7 是 pGEX_4T_l- SHA-4質粒在37°C、經終濃度分別為0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mMIPTG誘導6h的細菌總蛋白；
圖11是本發明海藻酸裂解酶SHA-4在不同溫度誘導下的表達情況，圖中:M是蛋白marker ； 1是pGEX-4T-l-S?-4質粒在37 °C未經IPTG誘導，12h的細菌總蛋白；2_6是pGEX-4T-l-S?-4質粒分別在15、20、25、28、30°C經終濃度為0.1mM IPTG誘導6h的細菌總蛋白；
圖12是本發明海藻酸裂解酶的純化電泳示意圖，圖中:M是蛋白marker ;1是純化前的細菌上清蛋白；2是純化后的流川液；3是純化后的洗滌液；4是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液；
圖13是本發明海藻酸裂解酶SHA-4的最適pH示意圖，圖中:菱形曲線為SHA-4蛋白在pH6.0-8.0磷酸鹽緩沖液中的活性示意圖；正方形曲線為SHA-4蛋白在pH8.0-9.0Tris-HCl緩沖液中的活性示意圖；
圖14是本發明海藻酸裂解酶SHA-4的最適溫度示意圖；
圖15是本發明海藻酸裂解酶SHA-4的金屬離子影響示意圖；
圖16是本發明海藻酸裂解酶SHA-4的底物特異性示意圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容，實施例中方法如無特殊說明的采用常規方法，使用的試劑如無特殊說明的使用常規市售試劑或按常規方法配制的試劑。
[0012]本實施例中試劑主要分為分子生物學實驗試劑，各種限制性內切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)及北京莊盟國際生物基因科技有限公司產品，質粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余試劑均為國產分析純；儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器；所有引物序列均在上海生工合成。
[0013]實施例\..Marinicatena algina tilytica SH-52 基因組 DNA 的制備與檢測本發明所用的Marinica tena algina tilytica SH-52為本實驗室篩選菌株，SH-52基因組DNA的制備采用普通細菌基因組提取方法，具體內容如下:取2mL過夜培養菌液于4°C，4000rpm離心2min，棄盡上清液，收集菌體；加入lOOul Solut1n I懸菌、30 μ 1 10%SDS和1 μ 1 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37°C孵育1小時；加入100 μ 1 15mol/L NaCl，混勻；加入20 μ 1 CTAB/NaCl 溶液(CTAB 10%, NaCl 0.7mol/L)，混勻，65°C，10 分鐘；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心5分鐘；取上清，加入2倍體積無水乙醇，0.1倍體積3mol/L NaOAC，_20°C放置30分鐘；12000rpm離心10分鐘；沉淀加入70%乙醇洗滌；沉淀干燥后，溶于20 μ 1 TE，-20°C保存。取2 μ 1基因組DNA用1%的瓊