7. 2)。[0052]圖6:為本發(fā)明應(yīng)用的pET-巧b空載體圖譜巧708bp)。
[005引圖7 :為本發(fā)明制備的重組表達(dá)質(zhì)粒祀T巧b-PLE的圖譜（7343bp)。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 實(shí)施例1 :PLE亞型基因的獲得
[0055] (1)將健康的大白豬（來源于湖北天種畜牧股份有限公司，為常規(guī)品種）放血處 死，剪取肝臟組織，從新鮮的肝組織中提取總RNA(提取方法采用寶生物工程大連有限公司 生產(chǎn)的試劑盒，按照試劑盒的說明書操作），通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)PLE1基因的5'和 3'端序列（GenBank登錄號(hào)X63323)設(shè)計(jì)PLE的擴(kuò)增PCR引物，并送交武漢擎科創(chuàng)新生物科 技有限公司合成，引物對(duì)的序列如下：
[0056]PLE-up:5'-ATGTGGCTTCTCCCGCTGGTCCTGA-3'
[0057]PLE-down:5'-CCTCAAGGTCAGCCGAGCCTCCCCT-3'
[0058] 按照下列步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：
[005引 （1)在Micro化be管中按照表1配制混合液，全量為6μL。
[0060] (2)在70°C保溫lOmin后迅速在冰上急冷2minW上。
[0061] (3)離屯、數(shù)秒鐘使RNA混合液聚集于管底。
[0062] (4)再按照表2在Micro化be管中配制混合液反轉(zhuǎn)錄體系。
[0063] (5)在 42°C保溫比。
[0064] (6)在70°C保溫15min后冰上冷卻，得到cDNA溶液。
[006引 （7)W上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如表3所示。PCR擴(kuò)增條件 設(shè)定為：94°C5min，94°Clmin，57°Clmin，72°C2min，30 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸lOmin。
[0066] 表1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系1
[0067]
[0070] 表3PLE的PCR擴(kuò)增體系
[0071]
[0072]PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過膠回收試劑盒膠回收后連接到PMD18-T載 體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨節(jié)青霉素100μg/ml的LB 平板培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，挑取菌落培養(yǎng)化后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克 隆送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。
[0073] 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析歸納后發(fā)現(xiàn)，除了獲得已見報(bào)道的7種PLE亞型（PLEUPLE2、 PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE)基因片段外，還發(fā)現(xiàn)了至少47種新亞型片段，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 的PLE亞型分類方法，按PLE亞型氨基酸序列中25個(gè)變異位點(diǎn)氨基酸的相似度，將運(yùn)54種 亞型片段分為7大類，分別用大寫字母A~G來表示，每一大類再用阿拉伯?dāng)?shù)字1~9進(jìn)行 區(qū)分。
[0074] 根據(jù)GenBank中PLE1開放閱讀框中成熟氨基酸序列（GenBank登錄號(hào)X63323)，設(shè) 計(jì)用于表達(dá)PLE的PCR擴(kuò)增引物，上游引物從去除信號(hào)膚之后的第55個(gè)核巧酸序列開始， 在5'端依次加上7個(gè)保護(hù)性堿基GGAATTC，NdeI酶切位點(diǎn)CATATG;下游引物去除編碼內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)滯留信號(hào)的12個(gè)核巧酸（CATGCTGAGCTG)，5'端依次加入3個(gè)保護(hù)性堿基CCG，化〇1酶切 位點(diǎn)CTCGAG和終止密碼子TCA。具體的引物對(duì)序列如下：
[00巧]上游引物：5 ' -GGAATTCCATATGGGGCAGCCAGCCTCGCC-3'
[0076]下游引物：5 ' -CCGCTCGAGTCACTTTATCTTGGGTGGCT-3'
[0077] 用含有PLE基因片段的PMD18-T為模板，使用上游引物和下游引物對(duì)PLE基因進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如表4所示，擴(kuò)增條件設(shè)定為：98°C2min，98°ClOsec，63°C15sec，72°C lmin，35個(gè)循環(huán)后72°C延伸5min。
[007引 表4PLE的PCR擴(kuò)增體系
[00701
[0080]_PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正??后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（購(gòu)自天根生4科 技有限公司）純化，然后用Ndel和化〇1進(jìn)行雙酶切，37°C條件下酶切1小時(shí)，酶切體系如 表5所示：
[0081] 表5雙酶切體系
[0082]
[0083] 同時(shí)也對(duì)載體祀T-15b(質(zhì)粒圖譜見說明書附圖圖6)用Ndel和化〇1雙酶切，37°C 條件下酶切1小時(shí)，酶切體系如表6所示：
[0084] 表6雙酶切體系
[0085]
[0086] 酶切后的PCR產(chǎn)物和載體祀T1化產(chǎn)物分別用膠回收試劑盒純化，然后于16°C條件 下過夜連接，連接體系如表7所示：
[0087] 表7連接體系
[0088]
[0089] 將所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨節(jié)青霉100Wg/ml 的LB平板培養(yǎng)基上，并在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，挑取菌落培養(yǎng)化后進(jìn)行菌液PCR鑒定， 引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增程序與表達(dá)PLE基因相同，擴(kuò)增體系建表8所示，擴(kuò)增條件設(shè)定為：94°C3mi η, 94°C30sec, 55°C30sec, 72°CImin，30 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸 5min。
[0090] 表8菌液PCR擴(kuò)增體系
[0091]
[0092] 取陽(yáng)性菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京）有限公司 提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切體系如表9所示：
[0093] 表9雙酶切體系
[0094]
[0095]
[009引經(jīng)雙酶切鑒定條帶大小正確后，交武漢擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明PLE目的基因片段正確插入到載體祀T-15b中，且無突變發(fā)生，將獲得的表達(dá)質(zhì)粒命名為 祀T巧b-PLE(質(zhì)粒圖譜見圖7)。
[0097] 實(shí)施例2:PLE基因的原核功能性表達(dá)
[0098] 為了表達(dá)出W可溶性形式存在且具有天然酶活性的PLE蛋白，本實(shí)施例選取了具 有trxB和gor雙突變的0;rigami?2 (DE3)為宿主菌（購(gòu)自MerckMillipore公司），該菌 可形成氧化性微環(huán)境利于重組蛋白二硫鍵的正確折疊，從而更有利于重組蛋白的可溶性表 達(dá)。關(guān)鍵是同時(shí)選取了分子伴侶pGro7(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司）作為表達(dá)的輔助 質(zhì)粒，通過表達(dá)分子伴侶pGro7輔助重組蛋白的正確折疊，從而大大提高了PLE蛋白的可溶 性表達(dá)。具體步驟如下：
[0099] 首先將分子伴侶質(zhì)粒pGro7轉(zhuǎn)化化igami?2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含 氯霉素20μg/mlLB瓊脂平板進(jìn)行篩選，37°C培養(yǎng)1化后，挑取平板上的單個(gè)菌落，擴(kuò)大培 養(yǎng)提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后，命名為化igami-pG;ro7。制備化igami-pG;ro7感受態(tài)，具體 步驟如下：
[0100] 1、大腸桿菌0rigami-pG;ro7感受態(tài)的制備：
[0101] (1)挑取單菌落：從含有氯霉素的平皿中挑取大腸桿菌化igami-pGro7菌落，接種 于2mLLB液體培養(yǎng)基中，放置搖床中，37°C2(K)r/min振蕩過夜。
[0102] (2)菌液復(fù)蘇：取500uL化igami-pGro7菌液接種到50血LB(無抗生素）的LB液 體培養(yǎng)基中，于37°C20化/min培養(yǎng)至ODe。。值達(dá)到0. 3-0. 4即可。
[010引 做冰浴：在無菌條件下將菌液轉(zhuǎn)移到無菌預(yù)冷的50mL離屯、管中，冰浴30min， 4°C300化/min離屯、lOmin，棄上清，將離屯、管倒置于無菌吸水紙上，使液體流盡回收細(xì)菌。
[0104] (4)重懸沉淀：菌體加入10血預(yù)冷的0.Imol/L化CI2輕輕重懸沉淀，冰浴30min， 4°CSOOOr/min離屯、lOmin。
[0105]妨重復(fù)上述步驟（3)、（4)各1次。
[0106] (6)分裝：沉淀中加入2血預(yù)冷的0.Imol/L的化CI2重懸后按每管100μL的量分 裝。加入無菌甘油至終濃度為15%，置-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0107] 取構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒祀T巧b-PLE(圖7)轉(zhuǎn)化化igami-pGro7感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn) 物涂布含氨節(jié)青霉素（Amp, 100μg/ml)和氯霉素（化1，20μg/ml)雙抗性的LB瓊脂平板進(jìn) 行篩選。37Γ培養(yǎng)1化后，挑取平板上的單個(gè)菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定。篩選出陽(yáng)性克隆， 將其命名為 0rigami-pGro7-pETl加-PLE。
[0108]2、PLE和pGro7 的共表達(dá)：
[0109] 無菌條件下取活化后的化igami-pG;ro7-pET15b-PLE菌液6血加入到600血 LB(Amp和化1雙抗性）LB液體培養(yǎng)基中，加入k阿拉伯糖化-Ar油inose)至終濃度為Img/ mL，首先誘導(dǎo)分子伴侶pG;ro7表達(dá)，放入搖床30°C20化/min條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)2-化 至菌液ODe。。值為0. 6-0. 8時(shí)加入異丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)至終濃度為40uM， 誘導(dǎo)PLE目的蛋白表達(dá)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，6小時(shí)后取出培養(yǎng)基，4°C50(K)r/min離屯、lOmin， 收集菌體，用PBS(常用憐酸鹽緩沖液，配方為：氯化鋼8g，氯化鐘0. 2g，憐酸氨二鋼1. 44g， 憐酸二氨鐘0. 27g，加雙蒸水至80〇111以調(diào)pH值為7. 4,在加雙蒸水定容至1L)重懸菌體，在 4°C5000r/min離屯、lOmin，重復(fù)2次。用十分之一培養(yǎng)基體積的PBS重懸菌體，然后進(jìn)行壓 力破碎至溶液澄清，4°C1000化/min離屯、收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)表 達(dá)的PLE蛋白W可溶性方式存在于上清中，分子量約為6化Da,與預(yù)期的PLE蛋白分子量一 致。
[0110] 3、表達(dá)產(chǎn)物的純化：
[011。 收集離屯、后的上清，經(jīng)0. 45um的濾膜過濾處理后，使用AKTApurifier全自動(dòng)層析 儀進(jìn)行純化。純化方法為：
[0112] (1)打開電腦主機(jī)和電腦電源，待儀器自檢完畢（例如：儀器型號(hào)為CU950上面的 3個(gè)指示燈完全點(diǎn)亮不閃爍），雙擊桌面上UNICORN圖標(biāo)，進(jìn)入操作界面。首先將A1管道放 入平衡液或bandingbuffering中，將B1管道放入高鹽溶液中或elutionbuffering中， 在syst